[发明专利]产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株及构建方法

说明书

本发明涉及一种产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株及构建方法，属于生物医药技术领域。所述基因工程菌株通过将金霉素产生菌中的参与金霉素合成C6位甲基化相关基因ctcK基因采用基因工程方法进行突变得到。本发明通过构建同源交换质粒，转入金霉素产生菌进行DNA同源重组的方法，将金霉素合成过程中负责甲基化步骤的ctcK基因用壮观霉素抗性基因替代，从而中断C6位的甲基化，得到产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌。该菌株的去甲基金霉素产量为16.8mg/L，去甲基四环素产量为50.7mg/L，而这两种产物为米诺环素和替加环素的合成前体，因此利用该菌株进行工业生产具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种基因工程菌株及构建方法，尤其涉及一种产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株及构建方法。

背景技术

四环素类抗生素是一类具有四并苯核心结构的广谱抗生素，可以抑制细菌蛋白质的合成，对常见的革兰氏阴性、阳性致病菌以及立克次体、支原体、衣原体、非典型分枝杆菌和阿米巴原虫等都有较好的效果。包括第一代四环素类抗生素四环素(tetracycline,TC)、金霉素(chlortetracycline,CTC)和土霉素(oxytetracycline,OTC)，它们分别由主要产金霉素的金黄色链霉菌(Streptomyces aureofacines)和产土霉素的龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)发酵产生，因广谱、使用方便、经济等特点广泛应用于医药、畜牧和水产业，全球市场需求巨大。由于细菌耐药性的出现，20世纪70年代开始应用半合成技术对四环素和土霉素进行化学修饰，得到了性能更好的第二代四环素类抗生素，如强力霉素和米诺环素。2005年美国食品药品管理局(FDA)批准替加环素上市，以此为代表的甘氨酰环素类抗生素被称为第三代四环素，是在第二代四环素的基础上合成的。

在化学半合成的四环素类抗生素中，米诺环素是抗菌作用最强的四环素类抗生素，临床上可用于治疗痤疮等，同时也具有抗炎症和自身免疫病，以及神经保护的作用，应用前景广泛。替加环素可用于临床治疗复杂皮肤及软组织感染(cSSSIs)和复杂腹腔内感染(cIAIs)，对抗万古霉素耐药肠球菌(VRE)、甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)、青霉素耐药肺炎链球菌(PRSP)等耐药菌，都有很好的抗菌效果。而它们在化学合成过程中的共同前体是去甲基金霉素(demeclocycline,DMCTC)和去甲基四环素(demecycline,DMTC)。目前，国内外对去甲基金霉素的研究相对较多，主要集中于分离和测定方法的改进、菌株诱变选育以及发酵培养基优化等。如专利文献CN103642886A中记载了一种利用金色链霉菌发酵生产去甲基金霉素的培养基和培养方法，其培养基组成中含有鱼油、糖蜜混合物、蚯蚓粉混合物、蛋白胨等，其去甲基金霉素的产量同国内常规发酵水平相比，提高了10％以上。

近年来随着分子遗传学和化学生物学研究的深入，可以利用代谢工程(metabolicengineering)特异性地对天然产物的生物合成途径进行遗传改造，由此获得可发酵产生所需抗生素及其衍生物的基因工程菌株。与化学合成相比，利用发酵的方式生产目的代谢产物可以有效地降低生产成本，减少环境污染。

经对现有技术文献检索，未发现通过敲除甲基转移反应相关基因改变该菌种次级代谢物组份和产量的相关技术报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种产生去甲基金霉素和去甲基四环素的基因工程菌株的构建方法。本发明的方法中将C6位甲基化相关基因进行了基因敲除，从而获得发酵时产生去甲基金霉素和去甲基四环素的菌种，采用这样的菌种发酵可以直接获得目标产物，节约了生产成本，简化了工艺流程，避免了工业污染。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：