[发明专利]一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中意蜂和中蜂葡萄糖脱氢酶的方法

权利要求书

1.一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中意蜂和中蜂葡萄糖脱氢酶的方法，其特征在于，包括：通过液相色谱串联质谱法检测待测蜂蜜中葡萄糖脱氢酶的特征肽段，所述特征肽段包括肽段：

意蜂蜜葡萄糖脱氢酶特征肽段：ITLDNNQSVQVR，

中蜂蜜葡萄糖脱氢酶特征肽段：FPYQPPFAWEILK；

在所述检测前包括对所述待测蜂蜜的预处理，步骤如下：

将所述待测蜂蜜溶解于去离子水中，离心后取上清作为蛋白质溶液与40 mM NH₄HCO₃溶液混合，后加入30 mM DTT溶液反应60min，再加入100 mM IAA溶液反应60min，再加入胰蛋白酶溶液于37℃过夜酶切，后加入FA以使胰蛋白酶失活，将酶切产物进行除盐后作为待检测样本；

所述待测蜂蜜和所述去离子水的比例为10g：10mL，所述蛋白质溶液、所述NH₄HCO₃溶液、所述DTT溶液、所述IAA溶液和所述胰蛋白酶溶液的体积比例为200μL：800μL：100μL：500μL：30μL；

所述液相色谱条件如下：

使用C18 色谱柱；

流动相组成：流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈；

流速：0.30 μL/min；进样量：5.0 µL；柱温：27 ℃;

梯度洗脱条件为：0-0.5 min，5%的B；0.5-1.0 min，5-15%的B；1.0-6.5 min，15-40%的B；6.5-7.0 min，40-95%的B；7.0-8.5 min，95%的B；8.5-8.6 min，95-5%B，8.6-10.0 min，5%的B；

所述质谱条件如下：

离子源参数：300-1500 m/z；鞘气的流速38；辅助气的流速15；挡锥气的流速0；电喷雾电压3.2 kV；离子导管的温度275℃；S-lens RF level设为60；离子源温度380℃；采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS²。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

A、对真实的中蜂蜜和意蜂蜜进行酶解，酶解产物除盐后干燥，用0.1%的甲酸水溶液复溶，然后进行液相色谱串联质谱检测；

B、根据液相色谱串联质谱检测结果，筛选出专属于意蜂蜜的葡萄糖脱氢酶的特征肽段和中蜂蜜的葡萄糖脱氢酶的特征肽段；

C、提取待测蜂蜜中的蛋白质，用胰蛋白酶进行酶切，对酶解产物除盐后作为待测样本，使用液相色谱串联质谱检测；

D、在质谱检测结果中提取筛选的特征肽段，以鉴别蜂蜜为意蜂蜜或中蜂蜜。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤A中采用纳升级高效液相色谱系统串联超高静电场轨道阱傅里叶变换台式质谱高分辨质谱仪；步骤C中采用三重四级杆或QExactive plus液质联用仪进行液相色谱串联质谱检测。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，意蜂蜜的葡萄糖脱氢酶的特征肽段ITLDNNQSVQVR在质谱中所产生的检测信号的母离子具有693.87042的质荷比，包含质荷比为1059.51776、944.49082的子离子，中蜂蜜的葡萄糖脱氢酶的特征肽段FPYQPPFAWEILK在质谱中所产生的检测信号的母离子具有818.43213的质荷比，包含质荷比为1100.61389、1003.56113的子离子，所有离子的检测允许偏差在10 ppm以内。