[发明专利]一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中意蜂和中蜂葡萄糖脱氢酶的方法

说明书

本发明涉及一种液相色谱串联质谱检测中蜂蜜和意蜂蜜的葡萄糖脱氢酶的方法，包括：筛选分别属于中蜂蜜和意蜂蜜中葡萄糖脱氢酶的特征肽段，建立液相色谱串联质谱检测方法，样品前处理，液相色谱分离以及串联质谱检测和数据分析；所述特征肽段包括意蜂葡萄糖脱氢酶特征肽段：ITLDNNQSVQVR和中蜂葡萄糖脱氢酶特征肽段：FPYQPPFAWEILK。本发明所提出的蜂蜜中葡萄糖脱氢酶的检测方法，具有较高的准确度、精确度和灵敏度，并且稳定性强，适用于区别意蜂蜜和中蜂蜜，尤其适用于中蜂蜜中掺入意蜂蜜的鉴别。该方法对保护蜂蜜消费者的权益和维护蜂产品行业的健康发展具有重要现实意义。

技术领域

本发明涉及食品检测领域，具体为一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中葡萄糖脱氢酶的方法，该方法适用于鉴别中蜂蜜和意蜂蜜。

背景技术

蜂蜜营养丰富、口感香甜，并且具有一定美容、润肠和保健等功效，深受人们喜爱。此外，蜂蜜中含有丰富的营养和活性物质，如酚酸、黄酮等，使得蜂蜜具有一定的药用价值，具有消炎、抗菌、抗氧化等作用，被用于医药和化妆品等方面。与意蜂蜜相比，中蜂蜜口感更佳，更受到消费者的喜爱，但是中蜂平均每群的产量只有意蜂1/5左右，从而导致市场供不应求。当前，中蜂蜜的价格大约是意蜂蜜的5-10倍左右。面对利益的诱惑，部分商家在中蜂蜜中掺入低价的意蜂蜜或者直接以糖浆制作掺假中蜂蜜，流入市场。掺假中蜂蜜不仅扰乱蜂蜜市场正常秩序，而且损害蜂农和消费者的权益。如何保证中蜂蜜的真实性，防止中蜂蜜中掺入意蜂蜜成为当前养蜂业急需解决的一项难题。

蜜蜂在酿造蜂蜜过程中，需要在蜂蜜中混入众多的酶类物质使蜂蜜酿制成熟，便于长时间存储，如葡萄糖脱氢酶、淀粉酶、超氧化物歧化酶等。中蜂蜜和意蜂蜜中均含有这些酶类物质，由于这些酶类物质是有蜜蜂分泌的，属于动物源性蛋白质，在表征蜂蜜的动物源性来源方面具有一定示踪作用。葡萄糖脱氢酶同时存在于意蜂蜜及中蜂蜜中，但在这两种蜂蜜中葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列不同，两者属于同源性蛋白质。葡萄糖脱氢酶是一种可溶性的蛋白，主要功能是在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的作用下催化葡萄糖生成葡萄糖酸，从而使得蜂蜜呈现酸性，使蜂蜜具有抗菌和长时间保鲜作用。

近年来，液相色谱串联质谱技术在蛋白质的定性和定量分析方面，具有显著的高选择性和高灵敏度优点，非常适用于复杂生物基质中蛋白质的准确表征、鉴定。目前，尚未报道采用该技术用于定量检测蜂蜜中葡萄糖脱氢酶。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种液相色谱串联质谱检测蜂蜜中葡萄糖脱氢酶的方法，通过意蜂蜜和中蜂蜜中葡萄糖脱氢酶的特有肽段的检测对生产和商业中的中蜂蜜和意蜂蜜的真假进行鉴定。

第一方面，本发明筛选出可用于液相色谱串联质谱鉴定中蜂蜜和意蜂蜜的葡萄糖脱氢酶的特征肽段组：

意蜂蜜葡萄糖脱氢酶的特征肽段：ITLDNNQSVQVR，

中蜂蜜葡萄糖脱氢酶的特征肽段：FPYQPPFAWEILK。

本发明根据意蜂蜜和中蜂蜜酶解产物的液相色谱串联质谱检测结果，成功筛选出意蜂蜜特征肽段：ITLDNNQSVQVR，中蜂蜜特征肽段：FPYQPPFAWEILK，两者特异性通过Uniprot数据库进行了验证。

进一步，意蜂蜜的葡萄糖脱氢酶的特征肽段ITLDNNQSVQVR在质谱中所产生的检测信号的母离子具有m/z 693.87042的质荷比，包含质荷比为m/z 1059.51776、m/z 944.49082的子离子。

中蜂蜜的葡萄糖脱氢酶的特征肽段FPYQPPFAWEILK在质谱中所产生的检测信号的母离子具有m/z 818.43213的质荷比，包含质荷比为m/z 1100.61389、m/z 1003.56113的子离子。