[发明专利]用于桑黄遗传表达的重组载体及构建方法和遗传转化方法

权利要求书

1.一种用于桑黄遗传表达的重组双元载体1301-SH-gpd的构建方法，其特征在于，步骤如下：

(a)以pCAMBIA-1301载体为模板，设计引物组：

HYG-F，其序列如SEQ ID No:1所示，

HYG-R，其序列如SEQ ID No:2所示，

进行PCR扩增，得到带有同源臂的潮霉素HYG表达盒片段；

(b)将pCAMBIA-1301载体双酶切，切除左边的CaMV35S启动子区和HYG潮霉素区，得到线性化pCAMBIA-1301载体，

(c)利用无缝克隆技术，将步骤a带有同源臂的HYG表达盒片段与步骤b线性化载体连接，得到重组载体1301-HYG，

(d)以桑黄DNA为模板，设计引物组：

gpdZ-F，其序列如SEQ ID No:3所示，

gpdZ-R，其序列如SEQ ID No:4所示，

进行PCR扩增，得到带有1301-HYG载体同源臂的gpd基因启动子片段，其序列如SEQ IDNo:11所示，

(e)将步骤c得到的1301-HYG载体单酶切，得到线性化载体，

(f)将步骤d得到的带有同源臂的gpd启动子和步骤e得到的线性化载体连接，得到重组载体1301-gpd-HYG，

(g)以桑黄DNA为模板，设计引物组：

gpdY-F，其序列如SEQ ID No:5所示，

gpdY-R，其序列如SEQ ID No:6所示，

进行PCR扩增，得到带有1301-gpd-HYG载体同源臂的gpd启动子片段，其序列如SEQ IDNo:12所示，

(h)将步骤f得到的1301-gpd-HYG载体双酶切，切除右边的CaMV35S启动子区，得到线性化载体，

(i)将步骤g得到的带有同源臂的gpd启动子和步骤h得到的线性化载体连接，得到重组双元载体1301-SH-gpd，其序列如SEQ ID No:13所示。

2.一种根癌农杆菌介导的桑黄遗传转化方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)利用冻融法将所述的重组双元载体1301-SH-gpd转入根癌农杆菌AGL-1感受态，28℃培养1-2天，培养获得阳性菌；其中，所述的重组双元载体1301-SH-gpd其序列如SEQ IDNo:13所示，

(2)将培养好的桑黄菌丝无菌条件下粉碎，菌丝匀浆20s，随后将菌丝置于离心管，5000rpm离心10min，收集沉淀菌丝；

(3)含不同浓度潮霉素：0μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL的PDA平板上接种桑黄菌丝，得到适用于桑黄遗传转化的潮霉素浓度为4μg/mL；

(4)将含有重组双元载体1301-SH-gpd的AGL-1农杆菌菌液加入到100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中；培养至OD₆₀₀为0.5-0.6，将培养好的菌液5000rpm离心10min弃上清，沉淀用IM培养基含有200μmol/L乙酰丁香酮和20μL 25％吐温80，重悬至OD₆₀₀为0.6-0.7；

(5)取步骤(4)得到的侵染液侵染步骤(2)得到的桑黄菌丝，共培养36h，液体离心，随后收集菌丝，收集沉淀，0.2g沉淀物用1mL侵染液重悬，取200μL混合液体接种于含有200μmol/L乙酰丁香酮的Co-IM培养基，每个培养基约含有1.6×10⁵个菌丝片段，共培养36h，培养温度为25℃

(6)步骤(6)首先将低熔点PDA培养基溶化后，冷却至29-30℃，在步骤(5)得到的共培养菌丝上覆盖含有4μg/mL潮霉素和300μg/mL头孢噻肟钠的低熔点PDA培养基，培养3-4天，长出新菌落，随后将菌落转移至新的含有4μg/mL潮霉素的PDA培养基，培养5-7天，选取长势旺盛的菌落提取DNA，利用PCR技术鉴定阳性菌株，利用PCR技术鉴定阳性菌株的方法如下：

设计引物：

J1-F，其序列如SEQ ID No:7所示

J1-R，其序列如SEQ ID No:8所示

和

J2-F：其序列如SEQ ID No:9所示

J2-R:其序列如SEQ ID No:10所示；

以重组双元载体1301-SH-gpd、转化子和野生型DNA为模板进行PCR扩增，结果显示，从转化子和重组双元载体1301-SH-gpd都能扩增出253bp和1013bp的预期DNA片段，但野生型中没有扩增产物，说明重组双元载体上的外源DNA片段已经整合到了桑黄转化子的基因组中。