[发明专利]用于桑黄遗传表达的重组载体及构建方法和遗传转化方法有效
申请号: | 202010503531.8 | 申请日: | 2020-06-05 |
公开(公告)号: | CN111909953B | 公开(公告)日: | 2023-07-07 |
发明(设计)人: | 邹莉;王旭彤;孙婷婷;许昕薷;孙健;曲晓磊;王世新;刘增才;尹龙川 | 申请(专利权)人: | 东北林业大学 |
主分类号: | C12N15/80 | 分类号: | C12N15/80;C12N15/66;C12N15/65;C12N1/15;C12Q1/686;C12Q1/04;C12R1/645 |
代理公司: | 哈尔滨市哈科专利事务所有限责任公司 23101 | 代理人: | 吴振刚 |
地址: | 150040 黑龙江省哈尔*** | 国省代码: | 黑龙江;23 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 用于 遗传 表达 重组 载体 构建 方法 转化 | ||
本发明公开一种用于桑黄遗传表达的重组载体及构建方法和遗传转化方法。载体序列如SEQ ID No:13所示。构建方法:将双元载体pCAMBIA‑1301的CaMV35S启动子替换为桑黄同源启动子,获得适用于桑黄的双元载体。遗传转化方法:利用冻融法将重组双元载体转入根癌农杆菌,获得阳性菌;利用农杆菌侵染桑黄菌丝,并在培养基上共培养,随后覆盖低熔点PDA培养基;随后将菌落转移至新的培养基,选取长势旺盛的菌落提取DNA,利用PCR技术鉴定阳性菌株。本发明具有操作简单,转化率高等优点,成功实现了桑黄的遗传转化,使得在桑黄中进行同源敲除、过表达、异源表达成为可能,解决了无法建立桑黄遗传转化体系的问题。
技术领域
本发明属于遗传育种领域,具体涉及一种用于桑黄遗传表达的重组载体及构建方法和遗传转化方法。
背景技术
桑黄作为中国著名的传统药用真菌已经有2000多年的历史,最早见于前汉朝的《神农本草经》中的“桑耳”。《本草纲目》记载,桑黄可用于止泻、崩漏带下、脾虚泄泻,此外还能排毒、活血、利五脏。现代研究表明,桑黄具有调节免疫、抑制癌细胞增值、诱导癌细胞凋亡等作用,是目前国际公认的抗癌效果较好的药用真菌之一,其中发挥作用的有效成分主要是多糖、三萜、黄酮和酚类物质。
目前,关于桑黄药用成分的研究主要集中在分离纯化和药理活性上,但是与药用成分有关的基因功能及调控机制的研究还未见报道,其中主要的原因就是缺乏遗传转化方法,导致基因功能的研究受到阻碍,因此建立一个高效稳定的遗传转化体系是解析桑黄药用成分合成机制的关键步骤。
在遗传转化进行前需要一个适宜的载体,启动子是表达载体的重要组成部分,同源启动子可有效提高转化效率。目前桑黄缺少合适的载体,使得桑黄遗传转化很难开展。利用桑黄同源gpd启动子构建双元载体是建立桑黄遗传转化体系的首要任务。
真菌遗传转化的方法很多,如PEG法、基因枪法,农杆菌介导法等。农杆菌介导的遗传转化方法具有操作简单、转化效率较高、外源基因能稳定的整合在寄主染色体上等优点。目前,农杆菌介导的遗传转化法已经在许多真菌中成功应用,但是不同的真菌转化工艺存在差异,参照其他真菌的转化方法无法顺利进行转化。过往一直采用原生质体作为真菌的遗传转化受体,但是原生质体再生周期长,使得潮霉素失效,很难筛选到阳性转化株;并且制备原生质体步骤复杂,成本高污染率高,很难获得阳性转化株。本发明利用根癌农杆菌介导桑黄遗传转化,具有操作简单,转化率高等优点,成功实现了桑黄的遗传转化,使得在桑黄中进行同源敲除、过表达、异源表达成为可能,为利用基因工程手段对桑黄进行遗传改良,探究桑黄药用成分合成机制奠定基础。
发明内容
基于以上不足之处,本发明的目的是提供一种用于桑黄遗传表达的重组双元载体及构建方法,该载体能够在桑黄中表达,可用于研究基因功能和改造桑黄菌株,解决了无法建立桑黄遗传转化体系的问题。
本发明采用如下技术方案:一种用于桑黄遗传表达的重组双元载体1301-SH-gpd,其序列如SEQ ID No:13所示。
本发还具有如下技术特征:
如上所述的一种用于桑黄遗传表达的重组双元载体1301-SH-gpd的构建方法,步骤如下:
(a)以pCAMBIA-1301载体为模板,设计引物组:
HYG-F,其序列如SEQ ID No:1所示,
HYG-R,其序列如SEQ ID No:2所示,
进行PCR扩增,得到带有同源臂的HYG表达盒片段;
(b)将pCAMBIA-1301载体双酶切,切除左边的CaMV35S启动子区和HYG潮霉素区,得到线性化pCAMBIA-1301载体,
(c)利用无缝克隆技术,将步骤a带有同源臂的HYG表达盒片段与步骤b线性化载体连接,得到重组载体1301-HYG,
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