[发明专利]一种提高AMEP412蛋白产量的方法及其在激发植物免疫中的应用

说明书

本发明涉及一种提高AMEP412蛋白产量的方法及其在激发植物免疫中的应用。本发明发现了一种提高AMEP412在菌株中的表达水平和纯化效率的方法，可以提高AMEP412的表达产量，并将其应用在激发植物免疫中，提高其诱导过敏反应的功能活性，由此提高AMEP412在实际应用中的利用效率，为该蛋白的开发利用提供保障。

技术领域

本发明属于蛋白质表达、纯化与应用领域，涉及一种提高AMEP412蛋白产量的方法及其在激发植物免疫中的应用。

背景技术

AMEP412蛋白是一种在芽孢杆菌属菌株中广泛存在的蛋白。该蛋白全长76个氨 基酸，其相对分子质量为8.36kDa，但根据分子筛体积排阻色谱的结果，AMEP412实 际表现分子量为40-50kDa，形成了多聚体。AMEP412中50％的氨基酸为疏水氨基酸， 但由于其形成多聚体，能够屏蔽疏水侧面，从而能够溶解于水性溶液，存在于培养液 上清中。AMEP412具有2个带负电的残基和12个带正电的残基，理论上净电荷为正， 属于碱性蛋白质，等电点为10.05，但由于形成多聚体的原因，AMEP412在中性水溶 液中表现为净电荷为负，属于酸性蛋白质，能够通过阴离子交换树脂进行分离纯化。

经研究发现，AMEP412具有蛋白激发子的功能，能够激活植物免疫系统，引发 一系列防卫反应，如诱导植物发生过敏反应(Hypersensitive Response，HR)、引起活 性氧爆发、提高防御酶的表达，并减轻病原菌的侵染造成的损伤。AMEP412能够诱导 植物自身免疫防卫体系发生作用，综合提高植物自身代谢水平，增强防御病害和自然 胁迫的能力，进而提高作物产量和品质。AMEP412不会使病原物产生抗药性，对环境 也不会产生有害影响，具有开发为绿色生物制剂的潜力。

要将AMEP412进行应用性开发，高效获得大量高纯度的蛋白样品是关键。这包括两个方面的内容，一是提高蛋白质的表达水平，二是提高蛋白质的回收产率。

经研究发现，传统的重组表达方法并不适用于AMEP412蛋白。将AMEP412在大 肠杆菌重组表达系统中进行表达，AMEP412会对大肠杆菌细胞产生毒性作用，不会获 得表达产物。而其他重组表达系统，如芽孢杆菌重组表达系统、酵母重组表达系统、 昆虫杆状病毒重组表达系统、哺乳动物细胞重组表达系统等等，由于表达水平低下， 也不适用于AMEP412的表达。由此，研究如何通过野生型芽孢杆菌进行AMEP412蛋 白的高效表达是该蛋白开发利用的关键解决途径。

AMEP412在芽孢杆菌中表达，可分泌到培养液上清中。如何能够从培养液上清中高效回收AMEP412蛋白也是其开发利用的关键。培养液上清中有众多的杂蛋白、多肽 和小分子物质的干扰，增加了纯化的难度，再考虑到纯化方法应尽量简化，以降低应 用成本，AMEP412的高产率回收是一个难点和重点问题。

此外，AMEP412作为植物免疫激活剂在应用环节，仍有许多未完善的因素。蛋白 制剂一般以液体形式喷施到植物叶片上，而缓冲液的特性和组成成份会对蛋白制剂的 功能活性发挥产生影响。这需要深入分析AMEP412的蛋白特性，明确在施用环节中影 响其功能活性的因素，并针对性的做出改进措施，以提高蛋白质的利用效率。

发明内容

本发明的目的是提供一种提AMEP412蛋白产量的方法，并将其应用在激发植物免疫中，为该蛋白的开发利用打下基础。

本发明通过以下技术方案来实现：

一、一种提高AMEP412蛋白产量的方法，包括提高蛋白表达水平和回收产率两个方面。

进一步的，使用AMEP412蛋白的高效表达菌株贝莱斯芽孢杆菌BU396进行发酵 提高蛋白表达水平。