[发明专利]一种DNA特异性甲基化位点的制备及检测方法

权利要求书

1.一种DNA特异性甲基化位点的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

制备DNA 片段：从已知序列的双链DNA中选出欲甲基化的GpC位点，设计上游引物和下游引物，进行PCR反应；

构造特异甲基化位点：将制备的DNA 片段与S-腺苷甲硫氨酸和GpC甲基转移酶混合，37℃孵育6 h以上，对甲基化的DNA 片段进行纯化富集处理。

2.根据权利要求1所述的一种DNA特异性甲基化位点的制备方法，其特征在于，所述欲甲基化的GpC位点左右两侧，至少10个碱基内无胞嘧啶位点。

3. 根据权利要求1所述的一种DNA特异性甲基化位点的制备方法，其特征在于，所述构造特异甲基化位点还包括，对甲基化后的DNA片段加热到65 ℃-70 ℃保持20 min以上，灭活GpC甲基转移酶后，进行纯化富集处理。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法制备得到的DNA特异性甲基化位点的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤a：按照Rothemund的方法制备DNA折纸探针，进行纯化和浓缩回收；

步骤b：含有特异甲基化位点的DNA片段与新配亚硫酸氢钠溶液混合；设计上游引物与下游引物，进行PCR扩增，得到目标双链；对目标双链进行酶切，得到目标单链；设计三嵌段探针引物，用聚合酶进行延伸，得到特异甲基化位点的检测模板；

步骤c：将DNA 折纸探针与步骤b中的检测模板混合，进行折纸探针的特异性标记；

步骤d：原子力显微镜下成像观察。

5.根据权利要求4所述的一种DNA特异性甲基化位点的检测方法，其特征在于，所述步骤b中上游引物的5’端修饰磷酸基团，下游引物的5’端修饰Cy3荧光分子。

6. 根据权利要求4所述的一种DNA特异性甲基化位点的检测方法，其特征在于，所述步骤b中PCR扩增采用EpiTaq HS DNA聚合酶进行扩增。

7. 根据权利要求4所述的一种DNA特异性甲基化位点的检测方法，其特征在于，所述步骤b中聚合酶包括Vent DNA聚合酶，所述聚合酶不具有核酸外切酶校读活性。

8.根据权利要求4所述的一种DNA特异性甲基化位点的检测方法，其特征在于，所述步骤b中加入金纳米颗粒增强延伸反应的特异性。

9.根据权利要求4所述的一种DNA特异性甲基化位点的检测方法，其特征在于，所述步骤d中原子力显微镜下成像观察的具体方法为：将步骤c最终样品滴在新剥离云母片上，静置吸附不少于3分钟，利用氮气吹干于AFM气相条件下观察。

10.根据权利要求9所述的一种DNA特异性甲基化位点的检测方法，其特征在于，所述滴在新剥离云母片上最终样品使用去离子水稀释。