[发明专利]一种DNA特异性甲基化位点的制备及检测方法

说明书

本发明公开了一种DNA特异性甲基化位点的制备及检测方法。构造特异甲基化位点，利用亚硫酸氨盐使含有特异性甲基化位点样品与对照样品形成序列差异，设计特异性三嵌段引物探针定位特异性甲基化位点，使用DNA折纸探针对三嵌段引物探针进行捕获，最后利用原子力是微镜观察表征。本发明具有单分子、高分辨率、可视化、生物相容性好等优点，可用于生物样本分析、临床基因诊断等研究领域。

技术领域

本发明涉及一种DNA特异性甲基化位点的制备及检测方法，属于纳米生物学及检测分析技术领域。

背景技术

表观遗传学（Epigenetics）是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传变化的一门学科。由于技术及生物体本身特点等原因, 目前研究较多的表观遗传机制主要集中在DNA甲基化和组蛋白修饰。DNA甲基化（Methylation）是指在DNA甲基化转移酶（DNMT）催化下，以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体，将活性甲基转移至DNA链中特定碱基上的化学修饰过程。DNA甲基化是一种表观（Epigenetic）修饰，它在不改变DNA序列的情况下，对个体的生长、发育、基因表达模式以及基因组的稳定性起到重要的调控作用，并且这种修饰在发育和细胞增殖的过程中是可以稳定传递的。近年来，大量研究又表明，DNA异常甲基化与肿瘤的发生、发展、细胞癌变有着密切的联系。

目前，针对DNA特异性甲基化位点的制备方法的报道寥寥无几，人们的研究主要集中在对其检测技术上。特异性甲基化位点的检测技术始于1992年，Frommer团队提出将亚硫酸氢盐转化与测序相结合来检测特定碱基的甲基化状态。之后，各种各样的检测技术不断涌现，其中主要包括亚硫酸氢盐转化与聚合酶链式反应（PCR）相结合的检测技术、基于限制性内切酶的检测技术以及基于甲基化敏感性限制性内切酶的检测技术。但是现有的这些方法还存在诸多的问题：如样品要求高，成本高，特异性低，存在假阳性等。

发明内容

本发明的目的在于克服现有背景技术中的不足，提供一种DNA特异性甲基化位点的制备及检测方法，实现对单个DNA分子的可视化检测和提高特异甲基化位点检测的分辨率。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

第一方面，本发明提供一种DNA特异性甲基化位点的制备方法，包括以下步骤：

制备DNA 片段：从已知序列的双链DNA中选出欲甲基化的GpC位点，设计上游引物和下游引物，进行PCR反应；

构造特异甲基化位点：将制备的DNA 片段与S-腺苷甲硫氨酸和GpC甲基转移酶混合，对甲基化的DNA 片段进行纯化富集处理。

结合第一方面，进一步的，所述欲甲基化的GpC位点左右两侧，至少10个碱基内无胞嘧啶位点。

进一步的，所述构造特异甲基化位点还包括，对甲基化后的DNA片段加热到65 ℃-70 ℃保持20 min以上，灭活GpC甲基转移酶后，进行纯化富集处理。

第二方面，本发明提供一种DNA特异性甲基化位点的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤a：制备DNA折纸探针，按照Rothemund的方法制备DNA折纸探针，进行纯化和浓缩回收；

步骤b：构建特异甲基化位点的检测模板，含有特异甲基化位点的DNA片段与新配亚硫酸氢钠溶液混合；设计上游引物与下游引物，进行PCR扩增，得到目标双链；对目标双链进行酶切，得到目标单链；设计三嵌段探针引物，用聚合酶进行延伸，得到特异甲基化位点的检测模板；

步骤c：折纸探针的特异性标记，将DNA 折纸探针与步骤b中的检测模板混合，进行折纸探针的特异性标记；

步骤d：原子力显微镜下成像观察。

结合第二方面，进一步的，所述步骤b中上游引物的5’端修饰磷酸基团，下游引物的5’端修饰Cy3荧光分子。