[发明专利]深部真菌感染标本中收集真菌孢子的方法

说明书

本发明公开了一种深部真菌感染标本中收集真菌孢子的方法，属于生物技术领域，包括以下连续步骤：(a)预处理：取深部真菌感染标本进行处理，收集包含真菌及代谢产物的混合物；(b)真菌培养：使用细胞针将混合物转移至真菌血培养瓶中，利用血培养仪进行常规真菌培养；(c)收集真菌孢子：将真菌血培养瓶中呈阳性的混合物离心、弃上清液，将沉淀物转移至内设有孔径为10μm生物过滤膜的2mL无菌EP管中，高速离心，过滤，收集真菌孢子。本方法相比常规方法能够快速、高效、准确的收集侵袭性真菌感染的病原菌，提高培养的阳性率。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及深部真菌感染标本中收集真菌孢子的方法。

背景技术

真菌是自然环境中广泛分布的微生物，也是人类皮肤和粘膜常见的共生菌。然而，在机体的免疫系统受损或功能屏障破坏的情况下，真菌就会侵入粘膜、内脏器官及深部组织，在特定条件下，可以播散引起全身感染，造成真菌血症和深部组织感染，有较高的致死率。目前发现的真菌有150万种，其中约500种是致病菌。近三十年来，由于恶性肿瘤、艾滋病、糖尿病、器官移植患者的增多，这些患者免疫力低下，又长期使用广谱抗生素、激素类药物及接受创伤性医疗等因素，侵袭性真菌感染的发病率及死亡率明显提升。另外，侵袭性真菌感染发病多隐匿，患者临床表现多无特异性，其微生物病原学的早期、准确诊断对于临床显得尤为重要。

目前真菌感染的病原学诊断的手段中，组织形态学染色及影像学检查阳性率低，真菌抗原及抗体检测特异性差，基因扩增技术由于受标本、扩增引物、扩增条件等因素限制，结果多不稳定，且微生物室常规真菌培养耗时长、时效性较差，难以满足临床早期诊治的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种深部真菌感染标本中收集真菌孢子的方法，能够快速、高效、准确的收集侵袭性真菌感染的病原菌。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种深部真菌感染标本中收集真菌孢子的方法，包括以下步骤：(a)预处理：取深部真菌感染标本进行处理，收集包含真菌及代谢产物的混合物；(b)真菌培养：使用细胞针将混合物转移至真菌血培养瓶中，利用血培养仪进行常规真菌培养；(c)收集真菌孢子：将真菌血培养瓶中呈阳性的混合物离心、弃上清液，将沉淀物转移至内设有孔径为10μm生物过滤膜的2mL无菌EP管中，高速离心，收集真菌孢子。

优选的，所述步骤(c)中离心的条件为：5000rpm离心5min；所述高速离心的条件为：14000rpm离心10min。

优选的，所述深部真菌感染标本为深部真菌感染组织、深部真菌感染体液以及肺泡灌洗液中的一种。

优选的，所述深部真菌感染组织的处理方法为：在无菌条件下，对深部真菌感染组织剪切研磨，将剪切研磨后的组织混合物经300目尼龙网过滤，使用0.01mol/LPBS溶液洗涤、过滤，之后转移至离心管中，加入5mL红细胞裂解液重悬，离心，弃上清液，将沉淀的混合物转移至真菌血培养瓶中。

优选的，所述离心的条件为：1500rpm离心15min。

优选的，所述深部真菌感染体液的处理方法为：取血液、脑脊液、胸水、腹水、胆汁以及引流液中的一种，离心后，弃上清液，采用细胞针将沉淀的混合物转移至真菌血培养瓶中。

优选的，所述离心条件为4000rpm离心5min。

优选的，所述肺泡灌洗液的处理方法为：取20μL肺泡灌洗液做细胞涂片，通过显微镜筛选出合格的标本；将合格的标本经300目尼龙网过滤，过滤液转移至离心管中离心，弃上清液，用细胞针将沉淀的混合物转移至真菌血培养瓶中。

优选的，所述合格标本为上皮细胞的总数占比不超过3％，红细胞的总数占比不超过10％。

优选的，所述离心的条件为：1500rpm离心15min。