[发明专利]基于褐藻的可靶向肝脏缓释功能因子外泌体的构建方法

权利要求书

1.一种基于褐藻的靶向肝脏缓释功能因子疏水性外泌体的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）将新鲜的褐藻水洗2-3遍，切碎，在0-4℃下匀浆1-2 min，得到褐藻汁，将褐藻汁过滤，收集滤液，将滤液分别在1000g下离心10 min、2000g下离心20 min、4000g离心30 min、10000g离心1 h，收集上清液，将上清液用体液外泌体提取试剂盒进行提取纯化，得到褐藻外泌体溶液，将褐藻外泌体溶液溶解于磷酸盐缓冲溶液PBS中，使得褐藻外泌体溶液的浓度为1-3mg/mL，得到外泌体-磷酸盐缓冲溶液；

（2）将1-3mg的配体和1-2mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶解于0.1-0.15 mL的二甲基亚砜DMSO中，并在45-55℃保持10-20 min，随后冷却至20-25℃，加入步骤（1）得到的外泌体-磷酸盐缓冲溶液2-4mL，反应2 h后，得到缀合物，采用蔗糖梯度溶液进行纯化，并将纯化后的外泌体溶解在PBS中，得到外泌体分散液；所述配体为胆酸、甘草酸、甘草次酸或甘露糖；

（3）将0.5-1.5 mg/mL疏水性活性成分溶液与步骤（2）获得的外泌体分散液混合，并保持溶质浓度≥10wt%，在室温下放置12-18 min，然后以10000 g的速度离心10min，再通过在4℃下以135000 g的速度离心90 min，收集沉淀即为负载疏水性活性成分的外泌体；所述疏水性活性成分溶液的溶剂由乙腈与乙醇按体积比1：1组成；所述疏水性活性成分溶液中的溶质为多酚、类黄酮、异类黄酮、胡萝卜素、维生素、蛋白或多糖。

2.一种基于褐藻的靶向肝脏缓释功能因子亲水性外泌体的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）将新鲜的褐藻水洗2-3遍，切碎，在0-4℃下匀浆1-2 min，得到褐藻汁，将褐藻汁过滤，收集滤液，将滤液分别在1000g下离心10 min、2000g下离心20 min、4000g离心30 min、10000g离心1 h，收集上清液，将上清液用体液外泌体提取试剂盒进行提取纯化，得到褐藻外泌体溶液，将褐藻外泌体溶液溶解于磷酸盐缓冲溶液PBS中，使得褐藻外泌体溶液的浓度为1-3mg/mL，得到外泌体-磷酸盐缓冲溶液；

（2）将1-3mg的配体和1-2mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶解于0.1-0.15 mL的二甲基亚砜DMSO中，并在45-55℃保持10-20 min，随后冷却至20-25℃，加入步骤（1）得到的外泌体-磷酸盐缓冲溶液2-4mL，反应2 h后，得到缀合物，采用蔗糖梯度溶液进行纯化，并将纯化后的外泌体溶解在PBS中，得到外泌体分散液；所述配体为胆酸、甘草酸、甘草次酸或甘露糖；

（3）将30-60 μL浓度为0.5-1.5 mg/mL的亲水性活性成分溶液与100-200 μL浓度为0.5-1.5 mg/mL的外泌体分散液电穿孔试管中混合，在350 V和150 ms的条件下，用电穿孔仪对电穿孔试管进行电穿孔；然后在37℃的条件下孵育使外泌体的膜融合，得到负载亲水性活性成分的外泌体；所述亲水性活性成分溶液中的溶质为溶解于水中的质量分数至少为0.001%的亲水性多糖、蛋白。