[发明专利]基于褐藻的可靶向肝脏缓释功能因子外泌体的构建方法

说明书

本发明公开了一种基于褐藻的可靶向肝脏缓释功能因子外泌体的构建方法，属于保健食品领域，该方法通过提取褐藻外泌体，并对其进行表面修饰，最终包覆功能因子，能够获得负载疏水性活性成分的外泌体、负载亲水性活性成分的外泌体以及负载两亲性活性成分的外泌体。该负载功能因子外泌体能够靶向肝脏，具有靶向性强、毒性低、稳定性高的特点。

技术领域

本发明属于保健食品领域，具体地涉及一种基于褐藻的可靶向肝脏缓释功能因子外泌体的构建方法。

背景技术

食品中的活性成分例如黄酮类化合物、酚酸、萜类化合物、类胡萝卜素等有着较强的抗癌、抗氧化、免疫调节、抗微生物等生理功能，能够参与人体生理及病理的调节和慢性病的防治，对人体的健康发挥着重要的作用。活性成分对肝脏的各种疾病例如慢性乙型肝炎、脂肪肝、肝衰竭、肝硬化等有着较好的防治作用，但是这些活性成分都易快速降解和失活，且有着较差的靶向性和生物利用度，需要包封在一些载体中，研究广泛的载体有乳液、脂质体、纳米粒、微胶囊等，但是这些材料虽然较好地解决了活性成分不稳定的缺点，但是依然没有解决靶向性差的缺陷，而且均存在一定的安全性问题。

外泌体作为活性物质的载体具有很多优势，比如外泌体更易储存且安全性较高，能提高活性物质的稳定性，具有较强的穿透各种生物屏障的能力，且可以避免免疫系统的吞噬。对于外泌体的提取，如今使用比较广泛的原材料有姜、蒜、葡萄、牛奶等，还没有发现研究褐藻中外泌体的提取与应用的相关报道，且无外泌体负载活性成分靶向肝脏的相关研究。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明目的是提供一种基于褐藻的可靶向肝脏缓释功能因子外泌体的构建方法，构建可靶向肝脏的包埋食品活性成分的外泌体载体，具有靶向性强、毒性低、生物利用率高等特点。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种基于褐藻的可靶向肝脏缓释功能因子疏水性外泌体的构建方法，具体包括以下步骤：

(1)将新鲜的褐藻水洗2-3遍，切碎，在0-4℃下匀浆1-2min，得到褐藻汁，将褐藻汁过滤，收集滤液，将滤液分别在1000g下离心10min、2000g下离心20min、4000g离心30min、10000g离心1h，收集上清液，将上清液用体液外泌体提取试剂盒进行提取纯化，得到褐藻外泌体溶液，将褐藻外泌体溶液溶解于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，使得褐藻外泌体溶液的浓度为1-3mg/mL，得到外泌体-磷酸盐缓冲溶液。

(2)将1-3mg的配体和1-2mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶解于0.1-0.15mL的二甲基亚砜(DMSO)中，并在45-55℃保持10-20min，随后冷却至20-25℃，加入步骤1得到的外泌体-磷酸盐缓冲溶液2-4mL，反应2h后，得到缀合物，采用蔗糖梯度溶液进行纯化，并将纯化后的外泌体溶解在PBS中，得到外泌体分散液。所述配体为胆酸、甘草酸、甘草次酸或甘露糖。

(3)将0.5-1.5mg/mL疏水性活性成分溶液与步骤2获得的外泌体分散体混合，并保持溶质浓度≥10wt％，在室温下放置12-18min，然后以10000g的速度离心10min，再通过在4℃下以135000g的速度离心90min，收集沉淀即为负载疏水性活性成分的外泌体。所述疏水性活性成分溶液的溶剂由乙腈与乙醇按体积比1：1组成。所述疏水性活性成分溶液中的溶质为多酚、类黄酮、异类黄酮、胡萝卜素及其衍生物、疏水性维生素、蛋白或多糖等。

本发明还提供了一种基于褐藻的可靶向肝脏缓释功能因子亲水性外泌体的构建方法，具体包括以下步骤：

(1)将新鲜的褐藻水洗2-3遍，切碎，在0-4℃下匀浆1-2min，得到褐藻汁，将褐藻汁过滤，收集滤液，将滤液分别在1000g下离心10min、2000g下离心20min、4000g离心30min、10000g离心1h，收集上清液，将上清液用体液外泌体提取试剂盒进行提取纯化，得到褐藻外泌体溶液，将褐藻外泌体溶液溶解于磷酸盐缓冲溶液(PBS)中，使得褐藻外泌体溶液的浓度为1-3mg/mL，得到外泌体-磷酸盐缓冲溶液。