[发明专利]用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的引物组、荧光试剂盒及方法

权利要求书

1.一种用于恒温扩增检测食品中甲型肝炎病毒的引物组，其特征在于，其包括外引物HAV-OF、HAV-OB，内引物HAV-IF、HAV-IB和环引物HAV-LB，其中，所述HAV-OF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述HAV-OB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述HAV-IF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述HAV-IB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述HAV-LB的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.一种用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的荧光试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×恒温扩增反应缓冲液、34×TB Green、BcaBEST酶、AMV逆转录酶。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含SEQ ID NO.6所示序列的核苷酸序列的质粒体外转录RNA，所述阴性对照为去核酸的超纯水。

5.一种用于恒温扩增荧光检测甲型肝炎病毒的方法，其特征在于，其包括如下步骤：

S1、从样品中提取RNA；

S2、对步骤S1提取的所述RNA进行等温扩增；其中，在反应体系中，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的外引物HAV-OF、SEQ ID NO.2所示的外引物HAV-OB、SEQ ID NO.3所示的内引物HAV-IF，SEQ ID NO.4所示的内引物HAV-IB、SEQ ID NO.5所示的环引物HAV-LB；

S3、结果判定：

若有“S”型荧光信号扩增曲线，Ct值35，则判断为阳性；

若无“S”型荧光信号扩增曲线，无Ct值或Ct值45则判断为阴性；

若Ct值在35-45之间，建议重复实验，若Ct值45，荧光信号扩增曲线有明显起峰，该样本判断为阳性，否则为阴性。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，所述等温扩增的反应体系采用25μL，含有按终浓度计的1×恒温扩增反应缓冲液，HAV-OF、HAV-OB的终浓度各0.2μM，HAV-IF、HAV-IB的终浓度各1.6μM，HAV-LB的终浓度为0.8μM，BcaBEST酶65U，AMV酶1U，0.34×TB Green及1μL样品RNA模板。

7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，所述等温扩增的反应体系25μL，具体如下：反应总体积为25μL，其中，所述反应体系中含有：2×恒温扩增反应缓冲液12.5μL，34×TB Green 0.25μL，102U/μL BcaBEST酶0.6μL，5U/μL AMV逆转录酶0.2μL，10μM外引物HAV-OF和HAV-OB 0.5μL，40μM内引物HAV-IF和HAV-IB 1μL，20μM环引物HAV-LB和TE缓冲液1μL，RNA模板1.0μL，其余为去核酸的超纯水补足25μL。

8.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，所述等温扩增的程序为63℃条件下反应45min。

9.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，在步骤S2中，同时设置以含有如SEQID NO.7所示序列的质粒体外转录RNA为阳性对照，以去核酸的超纯水为空白对照进行检测。