[发明专利]用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的引物组、荧光试剂盒及方法

说明书

本发明提供了用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的引物组、恒温荧光试剂盒及方法，引物组包括外引物HAV‑OF、HAV‑OB，内引物HAV‑IF、HAV‑IB和环引物HAV‑LB，采用本发明的引物组在恒温条件下逆转录扩增样品的病原体RNA，通过荧光信号扩增情况进行分析，可判定样品中是否含有甲型肝炎病毒。本发明为甲型肝炎病毒的核酸检测提供了快速有效、精准可靠的方法，具有简便、快速、灵敏度高、特异性强的特点，且成本较低，适用性广。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的引物组、荧光试剂盒及方法。

背景技术

甲型肝炎病毒(hepatitis A virus，HAV)甲型肝炎病毒呈全世界分布，可通过粪-口途径传播，或通过摄入受污染的食物和水，或通过人与人之间的交流传播，导致引发的甲型病毒性肝炎，从而危害人民群众健康。对于目前甲型肝炎病毒检测技术存在的问题主要在于：全基因组测序可准确鉴定病毒，但是目前的高通量测序平台测序时间较长，灵敏度相对较低。PCR技术简单快速，灵敏度高，但工作量大，操作繁琐，通量低。实时RT-PCR检测已被开发用于实验室检测甲型肝炎病毒，但是，这些检测方法有内在缺陷，要么需要高精度的放大仪器，要么需要复杂而精细的方法来检测放大产物。基因芯片通量高，但也易造成假阳性，费用昂贵。环介导等温扩增检测已被开发用于实验室检测甲型肝炎病毒，也存在着检测灵敏度不能完全检测出低含量甲型肝炎病毒的现象。总之，这些核酸检测技术都存在需要依赖昂贵仪器，检测成本较高，灵敏度相对较低，具有实验室限制性等一系列缺点；而且这些分子生物学检测对质量控制、操作环境和人员的专业能力要求较高，无法实现在基层的普及应用，无法满足食品中甲型肝炎病毒快速检测的需要。恒温扩增技术操作简单，不需要专业较高的技术人员即可进行操作，但是鉴于引物的设计难度较大，导致缺少恒温扩增的试剂。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的引物组，该引物组可特异、灵敏扩增甲型肝炎病毒。

为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案为：

一种用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的引物组，其包括外引物HAV-OF、HAV-OB，内引物HAV-IF、HAV-IB和环引物HAV-LB，其中，所述HAV-OF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述HAV-OB的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述HAV-IF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述HAV-IB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述HAV-LB的核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示。

一种用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的荧光试剂盒，该试剂盒包括：如上所述的引物组。

如上所述的荧光试剂盒，优选地，所述试剂盒还包括2×恒温扩增反应缓冲液、34×TB Green、BcaBEST酶、AMV逆转录酶。

优选地，所述BcaBEST酶浓度为102U/μL，AMV逆转录酶为5U/μL。

如上所述的恒温荧光试剂盒，优选地，该试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为含SEQ ID NO.6所示序列在内的核苷酸序列的质粒体外转录RNA，所述阴性对照为去核酸的灭菌水。

一种用于恒温扩增检测甲型肝炎病毒的方法，其包括如下步骤：

S1、从样品中提取RNA；

S2、对步骤S1提取的所述RNA进行等温扩增；其中，在反应体系中，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的外引物HAV-OF、SEQ ID NO.2所示的外引物HAV-OB、SEQ ID NO.3所示的内引物HAV-IF，SEQ ID NO.4所示的内引物HAV-IB、SEQ ID NO.5所示的环HAV-LB；

S3、结果判定：