[发明专利]非融合型抗桥粒芯糖蛋白DSG3兔源单克隆抗体的制备方法在审
申请号: | 202010513741.5 | 申请日: | 2020-06-08 |
公开(公告)号: | CN111606994A | 公开(公告)日: | 2020-09-01 |
发明(设计)人: | 熊丹 | 申请(专利权)人: | 湖南远泰生物技术有限公司 |
主分类号: | C07K16/18 | 分类号: | C07K16/18;C07K16/06;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/84 |
代理公司: | 成都君合集专利代理事务所(普通合伙) 51228 | 代理人: | 何巍 |
地址: | 410000 湖南省长沙*** | 国省代码: | 湖南;43 |
权利要求书: | 查看更多 | 说明书: | 查看更多 |
摘要: | |||
搜索关键词: | 融合 型抗桥粒芯 糖蛋白 dsg3 单克隆抗体 制备 方法 | ||
1.非融合型抗桥粒芯糖蛋白DSG3兔源单克隆抗体的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)选择适合的免疫动物,对其进行DSG3的免疫;
(2)提取免疫成功的动物血液,收集外周血单个核细胞,分离出能够分泌DSG3抗体的B淋巴细胞群;
(3)建立兔源单链抗体酵母展示库:获取B淋巴细胞群中具有编码抗体重链可变区和轻链可变区的DNA,组合成单链可变区片段,即ScFv片段,然后将其连入酵母表面展示载体pYD1,再将酵母表面展示载体pYD1转化入EBY100酵母细胞,培养后,筛选出能够与DSG3重组蛋白和V5 Tag抗体均能结合的双阳性酵母细胞;
(4)构建DSG3兔源单克隆抗体表达载体库:从筛选得到的双阳性酵母细胞中提取质粒DNA,在该质粒DNA中连入DNA控制表达序列,获得可表达抗体分子的DNA片段,接着该DNA片段连入毕赤酵母表达载体PZ中,形成毕赤酵母表达载体PZ重组质粒;
(5)构建DSG3兔源单克隆抗体酵母表达库:将毕赤酵母表达载体PZ重组质粒转化入酵母表达菌X33中,筛选能够分泌DSG3抗体的X33重组转化单克隆菌;
(6)获得能够稳定分泌DSG3抗体的X33重组转化单克隆菌株;
(7)对获得的DSG3兔源单克隆抗体进行纯化。
2.根据权利要求1所述的非融合型抗桥粒芯糖蛋白DSG3兔源单克隆抗体的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中,选择的免疫动物为年龄在三个月左右、体重2.5kg左右,健康的雄性新西兰大白兔。
3.根据权利要求2所述的非融合型抗桥粒芯糖蛋白DSG3兔源单克隆抗体的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中,具体的免疫过程如下:
(1.1)首次免疫前,经耳静脉取血作为阴性对照;
(1.2)制备首次免疫制剂和后续的加强免疫制剂,首次免疫制剂为,采用500μg抗原加入等体积的弗氏完全佐剂,混匀和乳化后制得;加强免疫制剂为,采用250μg等体积混合弗氏不完全佐剂,混匀和乳化后制得;其中,抗原包被量为10ng/孔;
(1.3)使用首次免疫制剂对选取的兔子进行四肢、腋下及背部皮下多点注射,进行首次免疫;
(1.4)首次免疫三周后,使用加强免疫制剂对兔子进行第二次免疫,之后每隔两周,对兔子进行第三次和第四次的免疫;
(1.5)第三次免疫7天后,经耳静脉取血,测定抗体效价。
4.根据权利要求1~3任一项所述的非融合型抗桥粒芯糖蛋白DSG3兔源单克隆抗体的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中,收集外周血单个核细胞的具体过程为:用含抗凝剂的血液收集管从免疫后的兔子耳静脉处收集外周血,用PBS缓冲液以1:1的比例进行稀释,在室温环境下,通过密度梯度离心法从外周血中分离得到外周血单个核细胞。
5.根据权利要求1~3任一项所述的非融合型抗桥粒芯糖蛋白DSG3兔源单克隆抗体的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)中,从外周血单个核细胞中分离出能够分泌DSG3抗体的B淋巴细胞群的具体过程为:用labelledkits对抗原做FITC标记,将得到的外周血单个核细胞重悬于FACS缓冲液中,加入7-AAD-PerCP、anti-IgM-PE、anti-IgG-APC以及FITC标记的抗原进行染色,抗体和标记的抗原按0.7-1.2μg/1×108cells加入,在冰上避光孵育25-35min,用FACS缓冲液洗涤两次,最后重悬于FACS缓冲液中,通过流式分选获取anti-IgM-PE,anti-IgG-APC以及FITC标记抗原呈阳性的活细胞群,该活细胞群即为能够分泌DSG3抗体的B淋巴细胞群。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息,商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于湖南远泰生物技术有限公司,未经湖南远泰生物技术有限公司许可,擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作,请联系【客服】
本文链接:http://www.vipzhuanli.com/pat/books/202010513741.5/1.html,转载请声明来源钻瓜专利网。
- 上一篇:一种发酵醇香型茶烟的制备工艺
- 下一篇:一种新能源汽车变速箱总成轴系拼装装置