[发明专利]非融合型抗桥粒芯糖蛋白DSG3兔源单克隆抗体的制备方法

说明书

本发明公开了非融合型抗桥粒芯糖蛋白DSG3兔源单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：1）选择适合的免疫动物，对其进行DSG3的免疫；2）提取免疫成功的动物血液，收集外周血单个核细胞，分离出能够分泌DSG3抗体的B淋巴细胞群；3）建立兔源单链抗体酵母展示库；4）构建DSG3兔源单克隆抗体表达载体库；5）构建DSG3兔源单克隆抗体酵母表达库：将毕赤酵母表达载体PZ重组质粒转化入酵母表达菌X33中，筛选能够分泌DSG3抗体的X33重组转化单克隆菌；6）获得能够稳定分泌DSG3抗体的X33重组转化单克隆菌株；7）对获得的DSG3兔源单克隆抗体进行纯化。本发明所述制备方法能够制备稳定的DSG3抗体，具有工业重现性，适合产业化推广应用。

技术领域

本发明涉及单克隆抗体制备技术领域，具体是指非融合型抗桥粒芯糖蛋白DSG3兔源单克隆抗体的制备方法。

背景技术

抗桥粒芯糖蛋白(DSG)为钙粘蛋白超家族成员之一，DSG所组成的桥粒在细胞间粘附过程中发挥重要作用。目前已发现四种DSG，其中DSG1及DSG3与皮肤科关系极为密切，是包括天疱疮在内的多种自身免疫以及部分遗传性大疱性疾病的靶点，同时越来越多的研究显示DSG可能在细胞的增殖、调亡与迁移过程中发挥重要作用，因此可能与鳞状细胞癌的发生、发展具有临床相关性。目前血清抗桥粒芯蛋白DSG3抗体检测已用于天疱疮的诊断，在天疱疮等疾病治疗性候选药物及诊断试剂盒开发中发挥着关键性的作用。

现有血清抗桥粒芯蛋白DSG3抗体为DSG3的鼠源单克隆抗体和DSG3的兔源多克隆抗体，其中鼠源单克隆抗体是通过B淋巴细胞融合肿瘤细胞，筛选能够分泌该抗体的融合细胞，通过该融合细胞的细胞株获得抗体，而兔多克隆抗体则是用免疫动物后的血清制备抗体。这两种制备抗体的方法，筛选的过程具有极大的随机性和不确定性，因此在无法获得该抗体的融合细胞株的情况下，是不能进行抗体的制备的，其不具有工业重现性，严重制约了该抗体的产业化生产和应用。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种通过基因工程手段，制备得到的兔源DSG3单克隆抗体，该抗体相较于鼠源DSG3单克隆抗体具有更高的亲和力和特异性，以及具有更多识别新型表位和小分子抗原的优点，该制备方法能够制备稳定的DSG3抗体，具有工业重现性，适合产业化推广应用。

为了实现上述目的，本发明通过下述技术方案实现：非融合型抗桥粒芯糖蛋白DSG3兔源单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)选择适合的免疫动物，对其进行DSG3的免疫；

(2)提取免疫成功的动物血液，收集外周血单个核细胞，分离出能够分泌DSG3抗体的B淋巴细胞群；

(3)建立兔源单链抗体酵母展示库：获取B淋巴细胞群中具有编码抗体重链可变区和轻链可变区的DNA，组合成单链可变区片段，即ScFv片段，然后将其连入酵母表面展示载体pYD1，再将酵母表面展示载体pYD1转化入EBY100酵母细胞，培养后，筛选出能够与DSG3重组蛋白和V5 Tag抗体均能结合的双阳性酵母细胞；

(4)构建DSG3兔源单克隆抗体表达载体库：从筛选得到的双阳性酵母细胞中提取质粒DNA，在该质粒DNA中连入DNA控制表达序列，获得可表达抗体分子的DNA片段，接着该DNA片段连入毕赤酵母表达载体PZ中，形成毕赤酵母表达载体PZ重组质粒；

(5)构建DSG3兔源单克隆抗体酵母表达库：将毕赤酵母表达载体PZ重组质粒转化入酵母表达菌X33中，筛选能够分泌DSG3抗体的X33重组转化单克隆菌；

(6)获得能够稳定分泌DSG3抗体的X33重组转化单克隆菌株；

(7)对获得的DSG3兔源单克隆抗体进行纯化。

为了更好地实现本发明的制备方法，进一步地，所述步骤(1)中，选择的免疫动物为年龄在三个月左右、体重2.5kg左右，健康的雄性新西兰大白兔。