[发明专利]一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒

权利要求书

1.一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，其特征在于：所述试剂盒自带的模块包括酶切试剂、加A尾、加接头、PCR扩增、杂交试剂、捕获试剂和PCR富集；自行采购的商业试剂有：纯化磁珠-贝克曼；链霉亲和素磁珠-thermo；RNA探针-安捷伦和乙醇-分析纯。

2.根据权利要求1所述的一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的使用方法，具体步骤为：

S1：进行化学酶切DNA 末端修复DNA；根据FFPE提取DNA的质量进行分级，根据不同质量的DNA匹配相应的酶切时间，活动反应液A；

S2：进行加A尾反应，取用40ul反应液A、8ul加A尾缓冲液和2ul加A尾酶混合后进行吹打混匀，在65℃反应30分钟后降至4℃保持，获得反应液B；

S3：进行加接头反应，取用60ul反应液B、25ul加接头缓冲液、5ul加接头酶、5ul接头和5ul水混合后进行吹打混匀，在20℃下反应15分钟后降至4℃保温，活动反应液C；

S4：进行第一步纯化反应，获得反应液D；

S5：进行文库扩增反应，取用15ul反应液D、25ul扩增混合液和10ul通用引物混合后进行吹打混匀，在95℃下反应5分钟后降至10℃保温，获得反应液E；

S6：进行第二步纯化反应，获得反应液F；

S7：进行杂交反应，获得反应液G；

S8：进行捕获反应，获得反应液H；

S9：进行PCR富集反应，取用20ul反应液H、25ul扩增混合液、2.5ul的Index 5X和2.5ul的Index 7X混合后进行吹打混匀，在95℃下反应45秒后降至10℃保温，获得反应液J；

S10：进行第三步纯化反应，获得反应液K；

S11：进行质控品数据分析。

3.根据权利要求2所述的一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，其特征在于：所述不同质量的DNA包括条带完整性好，无明显降解情况的优质DNA、条带完整性中，降解一般/抹带情况的良好DNA和条带完整性差，降解较重/集中在小片段情况的警戒DNA，优质DNA的酶切时间为25-30分钟，良好DNA的酶切时间为15-20分钟，警戒DNA的酶切时间为5-10分钟。

4.根据权利要求2所述的一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，其特征在于：所述S4进行第一步纯化反应，获得反应液D的具体步骤为：

S41:纯化磁珠提前在室温孵育30 min，使用之前vortex混匀;

S42:取80 ul纯化磁珠（样本：磁珠=1:0.8）加入至加接头的溶液中，vortex 30s，室温孵育10min;

S43:配置新鲜的75%乙醇;

S44:孵育后的混合液放置磁力架上，待上清液澄清后，将上清液倒出；

S45:加300 ul 75%乙醇，停留1 min，弃去，重复两次；

S46:离心，弃去残液，待磁珠干燥；

S47:加水18 ul洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5 min，放置磁力架上，回收，继续下步操作。

5.根据权利要求2所述的一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，其特征在于：所述S6进行第二步纯化反应，获得反应液F的具体步骤为：

S61：纯化磁珠提前在室温孵育30 min，使用之前vortex混匀；

S62：取50 ul纯化磁珠（样本：磁珠=1:1）加入至扩增文库的溶液中，vortex 30 s，室温孵育10 min；

S63：配置新鲜的75%乙醇；

S64：孵育后的混合液放置磁力架上，待上清澄清后，弃去；

S65：加300 ul 75%乙醇，停留1 min，弃去，重复两次；

S66：离心，弃去残液，待磁珠干燥；

S67：加18 ul水洗脱磁珠上的DNA，室温孵育5 min，放置磁力架上，回收，用于杂交反应。