[发明专利]一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒

说明书

本发明提供一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，所述试剂盒自带的模块包括酶切试剂、加A尾、加接头、PCR扩增、杂交试剂、捕获试剂和PCR富集；自行采购的商业试剂有：纯化磁珠‑贝克曼；链霉亲和素磁珠‑thermo；RNA探针‑安捷伦和乙醇‑分析纯，本发明样本产量更高，较物理打断，化学酶切对低起始量DNA建库更友好，样本通量灵活，可同时酶切1‑96个样本，省时高效，建库成本降低，减少样本转管的次数，可以降低样本转管错误造成的样本混淆错误，提高了操作可控性，低质量低投入量的DNA通过酶切建库，其复杂度及插入片段均在可控范围内，适用范围广且数据可靠。

技术领域

本发明涉及试剂盒技术领域，特指一种基于化学酶切法构建DNA 二代测序文库试剂盒。

背景技术

FFPE(Formalin-Fixed and Parrffin Embedded)是通过使用石蜡包埋处理福尔马林固定的样本，在常温下可长久保存，因此该处理模式是对肿瘤样本最常用的样本储存手段。FFPE样本具有以下特点： 1)核酸发生降解。福尔马林的固定容易使组织中的核酸发生不同程度的降解，石蜡的高温渗入过程进一步加速核酸的降解，保存的时间及环境也会使得核酸发生降解。2)分子之间交联。福尔马林的固定容易使组织中分子间交联。因此，如何使得FFPE提取的样本DNA在低质量及低起始量下，依然能够建库信息完整，是一个难题。

目前的建库技术主要依托于NGS，通过DNA片段化、末端修复、加接头、扩增、杂交捕获等，获得可上机测序的文库。通过上述建库过程可知，操作繁琐，极易丢失原始模板信息。因此，报证低质量低投入量的DNA建库可行，是本专利的出发点。本专利通过建立化学酶切的可操作程序及样本质控方式，根据样本情况选择最优的酶切条件，以此来建立一个完整的文库。相较于物理打断方式，化学酶切不仅适用样本质量范围广，对其样本起始投入量要求也低，但是建库质量在各方面均不亚于物理打断的数据。

因此，化学酶切满足FFPE样本的建库，并在成本、通量、质量、起始量等方面具有比物理打断显著的优势。

发明内容

针对以上问题，本发明提供了一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，样本产量更高，较物理打断，化学酶切对低起始量 DNA建库更友好，其打断后经过建库产量更高，复杂度也更高，样本通量灵活，可同时酶切1-96个样本，省时高效，建库成本降低，省却了特殊仪器及耗材，使得建库成本有了一定的下降空间，减少样本转管的次数，可以降低样本转管错误造成的样本混淆错误，提高了操作可控性，低质量低投入量的DNA通过酶切建库，其复杂度及插入片段均在可控范围内，适用范围广且数据可靠。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于化学酶切法构建DNA二代测序文库试剂盒，所述试剂盒自带的模块包括酶切试剂、加A尾、加接头、PCR扩增、杂交试剂、捕获试剂和PCR富集；自行采购的商业试剂有：纯化磁珠-贝克曼；链霉亲和素磁珠-thermo；RNA探针-安捷伦和乙醇-分析纯。

优选地，所述试剂盒的使用方法，具体步骤为：

S1：进行化学酶切DNA末端修复DNA；根据FFPE提取DNA的质量进行分级，根据不同质量的DNA匹配相应的酶切时间，活动反应液A；

S2：进行加A尾反应，取用40ul反应液A、8ul加A尾缓冲液和 2ul加A尾酶混合后进行吹打混匀，在65℃反应30分钟后降至4℃保持，获得反应液B；

S3：进行加接头反应，取用60ul反应液B、25ul加接头缓冲液、 5ul加接头酶、5ul接头和5ul水混合后进行吹打混匀，在20℃下反应15分钟后降至4℃保温，活动反应液C；

S4：进行第一步纯化反应，获得反应液D；