[发明专利]一种ATP依赖的甘露糖激酶及其在岩藻基乳糖合成中的应用

权利要求书

1.一种具有催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸功能的酶，其特征在于，选自如下(a)～(c)所述的多肽：

(a)由SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸功能由(a)衍生的多肽；

(c)与(a)中的氨基酸序列有70％以上同源性的氨基酸序列，且具有催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸功能的多肽。

2.一种多核苷酸，其特征在于，选自如下(d)～(f):

(d)编码权利要求1中(a)～(c)所述多肽的多核苷酸；

(e)编码权利要求1中(a)～(c)所述多肽的片段、类似物或衍生物的多核苷酸；

(f)在严格条件下与(d)或(e)限定的多核苷酸序列杂交且编码具有催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸功能多肽的多核苷酸；

(g)与(d)或(e)或(f)或(g)限定的多核苷酸序列有70％同一性且编码具有催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸功能多肽的多核苷酸。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，为(d)编码的多核苷酸，其基因序列为SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13中所示序列，所述多核苷酸为DNA或RNA。

4.一种重组载体，其特征在于：含有权利要求2或3所述的多核苷酸。

5.一种重组宿主细胞，其特征在于：转入了权利要求5所述的重组载体。所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞、植物细胞或动物细胞，或这些宿主细胞的后代。

6.提供用于发酵生产2'-岩藻糖基乳糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株，其特征在于，所述重组菌株通过强化表达乳糖透过酶、α-1,2-岩藻糖转移酶、以及糖外排转运蛋白基因表达，在此基础上，强化磷酸甘露糖变位酶基因，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶基因表达；进一步强化甘露糖激酶基因表达获得的。

优选地，乳糖透过酶基因来源于大肠杆菌，α-1,2-岩藻糖转移酶基因来源于幽门螺旋菌或者大肠杆菌，优选幽门螺旋菌；所述糖外排转运蛋白可选自伯氏耶尔森氏菌；磷酸甘露糖变位酶可选自来源于大肠杆菌，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶可选自来源于大肠杆菌，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶可选自来源于大肠杆菌，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶可选自来源于大肠杆菌；甘露糖激酶可选自来源于长双歧杆菌。

7.根据权利要求6所述的合成2'-岩藻糖基乳糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法，其构建方法包括以下步骤：

1)构建包含乳糖透过酶基因、α-1,2-岩藻糖转移酶基因、糖外排转运蛋白基因的重组表达载体pX1。

2)构建包含磷酸甘露糖变位酶基因，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶基因的重组表达载体pE1。

3)构建包含甘露糖激酶，磷酸甘露糖变位酶基因，甘露糖1-磷酸鸟苷转移酶基因，鸟苷二磷酸甘露糖4,6-脱水酶基因，鸟苷二磷酸岩藻糖合成酶基因的重组表达载体pE2。

4)将重组表达载体pX1和pE1电转化至谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株CglFL-1。

5)将重组表达载体pX1和pE2电转化至谷氨酸棒杆菌13032中，获得重组菌株CglFL-2。