[发明专利]一种ATP依赖的甘露糖激酶及其在岩藻基乳糖合成中的应用

说明书

本发明公开了一种ATP依赖的甘露糖激酶及其在岩藻基乳糖合成中的应用，选自如下(a)～(c)所述的多肽：(a)由SEQ ID NO.1或者SEQ ID NO.2或者SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化甘露糖6‑磷酸脱磷酸功能由(a)衍生的多肽：(c)与(a)中的氨基酸序列有同源性70％以上的氨基酸序列，且具有催化甘露糖转化为甘露糖1‑磷酸功能的多肽。本发明还公布了谷氨酸棒杆菌重组菌株构建方法及其在岩藻基乳糖生物合成中的应用，通过增强甘露糖激酶与甘露糖代谢合成岩藻糖途径相关酶、以及底物乳糖透过酶与产物岩藻基乳糖转运蛋白活性，获得谷氨酸棒杆菌重组菌株，以葡萄糖、甘露糖和乳糖为底物合成岩藻基乳糖。

技术领域

本发明属于生物制造领域，具体涉及一种ATP依赖的甘露糖激酶及其在岩藻基乳糖合成中的应用。

背景技术

人乳寡糖(主要包含岩藻基寡糖和唾液酸基寡糖)具有促进双歧杆菌在肠道上皮增殖和定殖，抑制病原菌黏附，维持婴儿肠道菌群平衡、参加机体免疫、促进脑部发育等生理功能，已逐渐成为人们关注的热点。目前欧盟已批准若干种人乳低聚寡糖作为食品配料，应用于婴幼儿用奶粉、老人用健康功能食品原材料以及医药品原材料中，市场前景非常广阔。迄今为止已鉴定了约200种结构各异的HMO，含量最为丰富同时最重要的是岩藻糖基乳糖。

目前人乳低聚寡糖主要依赖于化学合成，然而化学合成过程复杂，需要多步保护和去保护步骤，造成低选择性、低得率、溶剂有毒不适合于食品应用，同时化学合成需要昂贵的岩藻糖或者唾液酸作为底物，造成生产成本高，所以如何降低人乳寡糖的生产成本，提高合成效率和食品安全性已经成为迫切需要解决的问题；酶法催化合成岩藻基乳糖，往往需要昂贵的前体GDP-岩藻糖，且前体来源有限，难以实现大规模生产。与化学合成和酶法催化方法相比，微生物发酵法生产岩藻基乳糖具有明显优势；目前已经报道了多个微生物重组菌株用于发酵合成岩藻基乳糖如CN201610562080.9；CN201811072267.6；CN201811516891.0；CN201910093684.7等，这些菌株大都以葡萄糖或者岩藻糖和乳糖为原料发酵合成岩藻基乳糖；相关研究发现以甘露糖为碳源进行发酵时，岩藻基乳糖合成前体GDP-甘露糖细胞内积累量更高，因此相关专利CN201910396709.0公布了以甘露糖为原料制备岩藻基乳糖方法。在该专利中，甘露糖通过葡萄糖激酶转化为甘露糖6-磷酸，后者经过甘露糖6-磷酸变位酶转化为甘露糖1-磷酸，进而进入岩藻基乳糖合成途径，由于甘露糖6-磷酸也可以异构为果糖6-磷酸，被细胞代谢，所以该专利中甘露糖转化率较低。甘露糖1-糖激酶催化甘露糖和ATP转化为甘露糖1-磷酸和ADP，所获得的甘露糖1-磷酸可进入岩藻糖合成途径用于合成岩藻基乳糖，与CN201910396709.0专利报道路径相比，含有甘露糖1-糖激酶的岩藻基乳糖合成途径具有反应步骤短、效率高、降低细胞生长代谢消耗等优势；因此，筛选效率高且催化甘露糖转化为甘露糖1-磷酸的糖激酶，对于提升甘露糖转化为岩藻基乳糖的合成效率至关重要。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸的酶，在本发明中，这种具有催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸功能的酶命名为甘露糖激酶MK，选自如下(a)～(c)所述的多肽：

(a)由SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)由(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有催化甘露糖6-磷酸脱磷酸功能由(a)衍生的多肽；

在本领域中,用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。同时，在C末端或N末端添加一个或数个氨基酸，通常也不会改变蛋白质的功能。

(c)与(a)中的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列，且催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸功能的多肽。