[发明专利]基于氧化损伤碱基的荧光探针及用于直接检测DNA甲基化的试剂盒与方法

说明书

本发明属于生物分析领域，涉及基于氧化损伤碱基的荧光探针及用于直接检测DNA甲基化的试剂盒与方法。本发明首次开发了一种基于氧化损伤碱基的荧光探针，通过循环切割信号放大准确检测单个位点的DNA甲基化。hOGG1酶可以特异性切割8‑oxoG/5‑mC碱基对中的8‑oxoG碱基，但对8‑oxoG/U碱基对中的8‑oxoG碱基无活性。目标物甲基化DNA的存在可以在hOGG1酶的辅助下诱导荧光探针的循环裂解，从而导致增强的荧光信号。该方法灵敏度高，特异性好,可以检测单个甲基化位点，检测下限达到3.458×10^‑15M。而且该方法能在复杂的DNA混合体系中区分出0.01％的甲基化水平，也可以检测基因组中的DNA甲基化水平。

技术领域

本发明属于生物分析领域，具体涉及基于氧化损伤碱基的荧光探针用于直接检测DNA甲基化。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

DNA的表观遗传修饰无需改变基因编码序列而发生基因表达的可遗传变化。DNA甲基化是调节基因转录，细胞分化以及包括癌症在内的多种疾病的致病性的最重要的表观遗传事件之一。哺乳动物细胞DNA甲基化几乎只发生在CpG岛的胞嘧啶C-5位。在正常细胞中，跨越启动子区域的大多数CpG岛通常未甲基化，从而转录得以开始，因为启动子的甲基化能够抑制启动子的活性。因此，启动子的甲基化可能是染色体失活和功能丧失突变的另一种基因失活机制。

传统的DNA甲基化检测方法主要包括基于甲基化敏感的限制性内切酶消化、亲和富集和亚硫酸氢钠处理。然而，基于甲基化敏感的限制性内切酶消化容易因酶切不完全而导致假阳性结果。基于亲和富集的方法涉及甲基化胞嘧啶的特异性抗体或与甲基化丰富的CpG区域有亲和力的甲基结合结构域蛋白，它们非常昂贵且不稳定。亚硫酸氢钠处理可将未甲基化的胞嘧啶脱氨为尿嘧啶，而甲基胞嘧啶保持不变。亚硫酸氢钠法可区分甲基化胞嘧啶和胞嘧啶，目前被认为是DNA甲基化检测的金标准。甲基化特异性PCR(MSP)能精确地定位CpG岛的甲基化，具有极高的灵敏度，但由于DNA启动错误或亚硫酸氢钠转化不完全，它存在假阳性。此外，人们还开发了重甲基和头环抑制PCR方法来阻断未甲基DNA的扩增。值得注意的是，基于PCR的方法依赖于严格的引物/模板设计和精确优化的热循环。近年来，在亚硫酸氢钠处理的基础上，又出现了一些新的方法，例如依赖连接的检测法，超支化滚环扩增(HRCA)，二级等温扩增测定，基于表面等离振子共振(SPR)的测定，基于阳离子共轭聚合物(CCPs)的荧光共振能量转移(FRET)法用于DNA甲基化测定。但这些方法涉及到复杂的连接反应过程和DNA聚合酶扩增，限制了它们在临床实验室的广泛应用。另外，虽然一些基于亚硫酸氢钠处理的非PCR方法，如电化学发光法、eMethylsorb法已经被证明可以直接检测DNA甲基化，但是它们的灵敏度相对较低。

例如：基于PCR的方法通常涉及复杂的操作程序(例如特定的反应温度和循环数)，极大限制了方法的应用。例如，MS-AP-PCR使用限制性内切酶进行甲基化分析，需要特定的限制性酶切位点和放射性标记。MS-PCR可精确定位CpG岛中的甲基化状态，但它只能提供定性数据而不是定量分析。MS-qFRET有助于直接检测DNA甲基化，但需要将所有MSP引物的末端都进行标记，操作繁琐价格昂贵。甲基化DNA沉淀与荧光素酶融合锌指法的结合(MELZA)需构建要包含谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签的MBD克隆以及GST标记的zif268-荧光素酶，程序比较复杂。基于氧化石墨烯(GO)的电化学方法涉及到GO表面的合成及修饰、金纳米颗粒(AuNPs)在碳(GC)电极表面上的堆积等复杂的实验程序。超支化滚环扩增(HRCA)涉及到连接、酶的消化、扩增等步骤，其过程复杂耗时。NESA方法的灵敏度远低PCR。目前绝大部分方法都适用于检测CpG岛多个甲基化位点的检测，但发明人发现：很少有一种方法能直接对基因组DNA进行某一特定单个位点的甲基化分析。

发明内容