[发明专利]一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的试剂盒及方法

说明书

本发明提供了一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的试剂盒及方法，通过甲基叔丁基醚、甲醇和水三种溶剂的配制形成单相有机溶剂体系，即混合溶剂A，并将此单相有机溶剂体系作为血清/血浆中的高丰度蛋白的沉淀剂。与传统的有机或无机溶剂沉淀剂相比，显著提高对血清/血浆中的高丰度蛋白的去除效率、以及内源性低分子量蛋白和多肽与高丰度蛋白之间的解离效率；同时，通过混合溶剂B增加甲基叔丁基醚及去离子水的含量，将单相溶剂体系一步转换为有机和水两相溶剂体系，使疏水性脂质主要分布于有机相中，实现对血清/血浆中疏水性脂质组分的有效去除或提取、以及LMWPs的高效富集和纯化，进而提高了LMWPs的鉴定数目。

技术领域

本发明涉及一种富集方法，具体涉及一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的试剂盒及方法，尤其是一种基于甲基叔丁基醚/甲醇/水体系的去除血清/血浆中高丰度蛋白及脂质和富集内源性低分子量蛋白/多肽的试剂盒及方法。

背景技术

血液中内源性低分子量蛋白质与多肽(30kDa，缩写为：LMWPs)通常主要包括体内自身存在的活性多肽(如激素、细胞因子、神经肽等)以及体内蛋白质经特殊水解酶特异性水解的产物。由于其具有分质量小的特点，LMWPs可以从机体组织或病灶等各个位置自由通过内皮细胞进入血液。LMWPs作为参与生命活动中细胞分化、神经激素递质调节、炎症、肿瘤发生和发展、免疫细胞渗透等进程的产物，可以准确、灵敏地反映机体的生理和病理状态。因此，对血液等样本中LMWPs的研究可以为临床疾病的早期诊断、分期和分型，以及预后和药物安全性和有效性评估等方面提供高灵敏、高特异性的分子标志物。同时，针对内源性LMWP的活性酶相关性、后修饰以及与其相互作用蛋白质的更深入研究也将有助于探索疾病的发生、发展、转移机制等。因此，LMWPs在临床医学和生物制药等领域有着广阔的应用前景。

然而，目前血液中LMWPs的分析和鉴定仍面临着很大的挑战，主要原因如下：1)LMWPs的丰度比较低，其分析和鉴定往往容易受到血液中高丰度蛋白(占总含量的99％以上)屏蔽作用的影响；2)LMWPs容易被血液中存在的多种蛋白酶降解，导致其丰度进一步降低；3)由于其分子量小，容易被肾脏或肝脏快速的清除和吸收，导致LMWPs的半衰期比较短；4)为了避免被快速地清除，LMWPs往往选择依附于其他高丰度蛋白(载体蛋白)，如果不能有效的解离，容易导致在去除高丰度蛋白的过程中一并丢失。因此，对低分子量蛋白/多肽的提取和富集是系统分析和鉴定血液中LMWPs的重要前提步骤。

目前，针对血液中内源性LMWPs具有分子量小和丰度低的特点，研究者发展了许多不同的提取和富集方法，主要包括有机和无机溶剂沉淀方法、超滤技术(分子量截留膜)、固相萃取技术、免疫亲和法及凝胶分离法等。其中，有机和无机溶剂沉淀法，例如乙腈、甲醇和TCA等，由于具有操作简便、富集效率高的特点而备受青睐。尽管如此，由于血液样本的高度复杂性和大量高丰度蛋白质的存在，使得这些方法在LMWPs分析和鉴定中的应用仍存在一定的局限性。

发明内容

针对以上现有技术存在的不足之处，本发明提供了一种用于富集血清/血浆中内源性低分子量蛋白和多肽的方法，能够将血清/血浆中的高丰度蛋白及脂质的去除与内源性低分子量蛋白/多肽(LMWPs)的富集同时进行，以克服传统的有机或无机溶剂沉淀法等在血清/血浆中的高丰度蛋白的去除、以及LMWPs与高丰度蛋白解离等方面效率的不足的问题。

本发明第一方面提供了一种用于富集内源性低分子量蛋白和多肽的试剂盒，包括用于盛放溶剂的容器，所述容器盛放的溶液包括：

混合溶剂A，包括去离子水、甲基叔丁基醚和甲醇，用于使血清/血浆样本处于单相有机溶剂体系中，实现对高丰度蛋白沉淀析出；

混合溶剂B，包括去离子水和甲基叔丁基醚，用于将含有所述血清/血浆样本的单相有机溶剂体系转换成有机和水两相溶剂体系，使所述血清/血浆样本中的疏水性脂质位于有机相中，以便对疏水性脂质分离。