[发明专利]一种猴头菌高产麦角甾醇优良菌株的选育方法及猴头菌株

权利要求书

1.一种猴头菌株，其特征在于：其保藏编号为CGMCC No.19374。

2.一种猴头菌高产麦角甾醇优良菌株的选育方法，其特征在于：所述选育，其步骤为：

原生质体制备和再生：将4℃菌种库中取出的猴头斜面，放置于26℃恒温培养箱中黑暗环境下活化；24小时后，取斜面靠近试管底部菌丝体块接种于PDA平板中心位置，26℃恒温培养10天培养；取PDA平板上最外环生长旺盛的猴头菌块接种于100mL PDB液态发酵种子培养基中发酵培养，将发酵菌丝体置于1.8mL EP管中，经无菌水反复清洗，无菌干燥滤纸吸干菌丝表面水分；每200mg菌丝加入1mL混合酶液，混合酶液组分为1.0％溶壁酶、0.5％蜗牛酶、0.25％崩溃酶，置于28℃恒温振荡器，转速80rpm/min酶解，2小时后采用砂芯漏斗过滤菌液，4℃，4000r/min离心15min，弃上清，所得沉淀用0.6mol/L甘露醇反复清洗3次，获得猴头原生质体；用1mL 0.6mol/L甘露醇等渗溶液溶解；再生培养基由蔗糖0.6mol/L，PDA 39g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L组成；

原生质体的灭活：取1mL浓度为2.0×10⁶个/mL的0605原生质体悬液均匀平铺在无菌培养皿中，敞口放在无菌紫外交联仪中20W紫外灯照射，照射时间为8s；取1mL浓度为2.0×10⁶个/mL的猴刺原生质体悬液于1.8mL无菌EP管中，置于恒温水浴锅中，水浴温度设置为58℃、100min灭活；

原生质体融合：将灭活后的猴头菌0605、猴刺原生质体进行化学融合：取灭活后的0605、猴刺原生质体悬液各200μL于无菌1.8mLEP管中，用移液枪轻轻吹打使其混合均匀，4℃，12000rpm，离心30s去上清液；逐滴缓慢加入300μL由0.002mol/L Mg²⁺和0.008mol/L Ca²⁺配制成的PH为7.5的35％PEG6000，静止8min；4℃，12000rpm，离心30s去融合液；逐滴缓慢加入800μL由0.004mol/LMg²⁺和0.010mol/L Ca²⁺配制成的PH为7.5的30％PEG6000，静止8min；4℃，12000rpm，离心30s去融合液；逐滴缓慢加入1mL由0.005mol/L Mg²⁺和0.012mol/LCa²⁺配制成的PH为9.5的25％PEG6000，静止8min；融合结束后4℃，12000rpm，离心10min去上清液，所得沉淀用等渗溶液0.06mol/L甘露醇冲洗3次，得到的沉淀加入1mL等渗溶液0.06mol/L甘露醇，取200μL涂布于再生平板上，放置于26℃黑暗培养。

3.如权利要求2所述的猴头菌高产麦角甾醇优良菌株的选育方法，其特征在于：还包括，将再生平板上的再生菌落单独挑出至PDA平板上，放置于26℃黑暗培养10天，接种于种子培养基中，26℃，150rpm培养7天，培养结束后过滤，筛选得到融合子R51*。

4.如权利要求2所述的猴头菌高产麦角甾醇优良菌株的选育方法，其特征在于：发酵培养方法为：

一级种子发酵摇瓶培养：无菌环境下，取PDA平板培养基上生长旺盛的菌丝于100mLPDB液态发酵种子培养基中在150r/min、26℃条件下恒温培养8天；

二级扩大发酵摇瓶培养：在无菌环境中，将一级种子发酵摇瓶培养获得菌液倒入组织匀浆机中，均质30s，以15％(V/V)的接种量接入二级扩大发酵培养基中，在黑暗中恒温26℃、150r/min培养7d，无菌纱布过滤收集菌丝体，ddH₂O反复清洗3次，冷冻干燥，获得干菌丝体。

5.如权利要求4所述的猴头菌高产麦角甾醇优良菌株的选育方法，其特征在于：所述液态发酵种子培养基，其配方为PDB 20g/L，KH₂PO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O0.5g/L。