[发明专利]一种猴头菌高产麦角甾醇优良菌株的选育方法及猴头菌株

说明书

本发明公开了一种猴头菌高产麦角甾醇优良菌株的选育方法及猴头菌株，其保藏编号为CGMCC No.19374，本发明原生质体融合育种，融合菌株R51*的菌丝生长速度、生物量、麦角甾醇含量均显著高于对照菌株。本发明优化融合育种方法，猴头菌原生质体融合率得到显著提高。本发明通过分多步骤、逐级降低PEG浓度同时提高Mg²⁺、Ca²⁺浓度来降低对原生质体的毒害作用，从而大大提高了原生质体融合效率。

技术领域

本发明属于微生物育种技术领域，具体涉及一种猴头菌高产麦角甾醇优良菌株的选育方法及猴头菌株。

背景技术

猴头菌又称刺猬菌、菜花菌、猴头菇、山伏菌等,大多数生长在山野丛林里，是一种有名的药食同源菌,属于担子菌门、层菌纲、非褶菌目、猴头菇科、猴头菇属。猴头菌的子实体长得像猴子头，因此而得名。

我国的猴头菇历史悠远，可追溯到公元220年时期，沈莹撰写《临江水土异物志》中就已有明确记载。明清时期，猴头菇更是作为贡品，广受关注。研究表明，猴头菌含有多种活性物质。

猴头菌可促进血液循环，抑制肿瘤细胞，保护胃黏膜，其中甾醇类物质在延缓衰老、预防心血管疾病等方面有显著功效。研究表明，食用菌中甾醇类物质特别是麦角甾醇表现出优良的抗炎作用。张一帆等在研究假芝的抗肿瘤功效时发现，麦角甾醇是通过促进细胞凋亡实现抑制肿瘤生长。如今，我国消费者对麦角甾醇的需求量越来越大，因此，麦角甾醇高产菌株的筛选也已成为研究热点之一。如何获得具备液态发酵工业生产所需高产麦角甾醇的同时还具备良好出菇性能的菌株是有待解决的技术难题。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

作为本发明其中一个方面，本发明提供一种猴头菌株，其保藏编号为CGMCCNo.19374。

作为本发明的另一个方面，本发明提供一种猴头菌高产麦角甾醇优良菌株的选育方法，所述选育，其步骤为：

原生质体制备和再生：将4℃菌种库中取出的猴头斜面，放置于26℃恒温培养箱中黑暗环境下活化；24小时后，取斜面靠近试管底部菌丝体块接种于PDA平板中心位置，26℃恒温培养10天培养；取PDA平板上最外环生长旺盛的猴头菌块接种于100m L PDB液态发酵种子培养基中发酵培养，将发酵菌丝体置于1.8mL EP管中，经无菌水反复清洗，无菌干燥滤纸吸干菌丝表面水分；每200mg菌丝加入1mL混合酶液，混合酶液组分为1.0％溶壁酶、0.5％蜗牛酶、0.25％崩溃酶，置于28℃恒温振荡器，转速80rpm/min酶解，2小时后采用砂芯漏斗过滤菌液，4℃，4000r/min离心15min，弃上清，所得沉淀用0.6mol/L甘露醇反复清洗3次，获得猴头原生质体；用1mL 0.6mol/L甘露醇等渗溶液溶解；再生培养基由蔗糖0.6mol/L，PDA39g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L组成；

原生质体的灭活：取1mL浓度为2.0×10⁶个/mL的0605原生质体悬液均匀平铺在无菌培养皿中，敞口放在无菌紫外交联仪中20W紫外灯照射，照射时间为8s；取1mL浓度为2.0×10⁶个/mL的猴刺原生质体悬液于1.8mL无菌EP管中，置于恒温水浴锅中，水浴温度设置为58℃、100min灭活；