[发明专利]作为急性脑梗死诊断标志物的血清外泌体miR-410-3p的应用及其检测方法

权利要求书

1.一种作为急性脑梗死诊断标志物的血清外泌体miR-410-3p，其特征在于，所述血清外泌体miR-410-3p的序列为：AATATAACACAGATGGCCTGT。

2.一种作为急性脑梗死诊断标志物的血清外泌体miR-410-3p的应用，其特征在于，用于急性脑梗死诊断和治疗的生物标志物。

3.一种作为急性脑梗死诊断标志物的血清外泌体miR-410-3p的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）收集血清；

（2）分离血清中的外泌体，通过Illumina对血清中的外泌体进行small RNA测序，从中获得miRNAs表达谱，进行生物信息学分析筛选样品间差异表达miRNAs；

（3）实时荧光定量聚合酶链式反应技术分析脑组织特异性的miR-410-3p在脑卒中患者和健康人群血清外泌体中的表达。

4.根据权利要求3所述的作为急性脑梗死诊断标志物的血清外泌体miR-410-3p的检测方法，其特征在于，步骤（2）的具体步骤为：

（2-1）外泌体RNA的抽提取；

（2-1-1）将保存于-80℃的血清220-260μl在冰上融化，21000g、4℃离心15 min；

（2-1-2）将上清转移至新的EP管中，加入1/4体积的ExoQuick溶液轻轻颠倒混匀，4℃孵育30 min，13500g离心5min，去除上清，保留沉淀备用；

（2-1-3）加PBS 重悬外泌体沉淀，加入3倍TRIZOL LS 试剂抽提RNA，每管样品加入100fmol miRNA 标准品Cel- mir-39，最后提取的RNA沉淀用RNA Free H₂O 溶解；

（2-2）小RNAs文库的构建和上机测序

（2-2-1）样品检测合格后，用Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina试剂盒进行外泌体小RNAs文库构建；

（2-2-2）分别在外泌体总RNAs 3'端和5'端连接上接头，反转录合成cDNA；

（2-2-3）PCR富集后，采用胶分离技术筛选目的片段，从8%PAGE凝胶中切胶回收140bp的条带，并使用Agilent Bioanalyzer 2100芯片评估文库质量及长度；

（2-2-4）库检合格后，采用 illumine Hiseq 2500 测序平台的单端 125 bp 测序模式对样本进行高通量测序；

（2-3）测序数据分析

（2-3-1）Illumina HiSeq2500 平台测序得到的原始图像数据文件经碱基识别转化为原始测序序列，结果以FASTQ文件格式存储；将raw data 去除含有接头，含 ploy-N和低质量的Reads，以及长度过滤，最终得到Clean reads；所有的下游分析都基于高质量的cleandata；利用Bowtie软件，将Clean Reads分别与Silva数据库、 GtRNAdb数据库、Rfam数据库和Repbase 数据库进行序列比对，过滤核糖体 RNA、转运RNAs、核内小RNAs、核仁小RNAs等ncRNAs以及重复序列，获得包含miRNAs的Unannotated reads；最后，利用miRDeep2软件进行已知miRNAs鉴定和新miRNAs预测；

（2-3-2）比较脑卒中患者和健康人群血清外泌体中之间miRNAs 的表达，以寻找差异表达的miRNAs：将两组样本miRNAs的表达归一化，即把miR-39 的reads数用10000来归一化；当某个miRNA的归一化表达为零时，将其表达值修改为0.01；在miRNA reads数归一化之后，用归一化后的数据计算log2 倍数变化和P值；当miRNAs的p值≤0.05，|log2fold-change|≥1 时，miRNAs被定为差异表达。

5.根据权利要求3所述的作为急性脑梗死诊断标志物的血清外泌体miR-410-3p的检测方法，其特征在于，步骤（3）为外泌体RNA抽提及实时定量PCR，具体步骤为：

（3-1）采用trizol法抽提血清外泌体的总RNA：使用超微量紫外分光光度计对RNAs进行定量和纯度测定；采用基于poly-A加尾法的miDETECT A Track™ miRNA qRT-PCR试剂盒和CFX 96 PCR仪检测miR-410-3p；

（3-2）研究血清外泌体中miR-410-3p的表达：采用Q-PCR检测血清外泌体中miR-410-3p，用加入的Cel- mir-39作为外参，2^-ΔΔCT表示目的基因的相对表达水平。