[发明专利]基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组和试剂盒

权利要求书

1.一种基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组，其特征在于，包括上游引物EHP-qF66、下游引物EHP-qR66和TaqMan-MGB探针EHP-qP66，序列如下：

EHP-qF66：5’-CGCGGTAATTCCAACTCCAA-3’，SEQ ID No.1；

EHP-qR66：5’-TCTACGACTACGGACCCTTTAACTG-3’，SEQ ID No.2；

EHP-qP66：5’-FAM-AGTGTCTATGGTGGATGCT-MGB-3’，SEQ ID No.3；

其中，EHP-qP66的5′端标记荧光染料FAM、3′端标记MGB基团。

2.一种基于权利要求1所述引物组的检测试剂盒，其特征在于，包括反应液、工作标准品、阳性对照和阴性对照。

3.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述反应液包括2×Probe qPCRPremix Ex Taq^TM、ROX Reference DyeⅡ、上游引物EHP-qF66和下游引物EHP-qR66、TaqMan-MGB探针EHP-qP66和灭菌ddH₂O。

4.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述反应液共2.3mL；每剂反应液为45μL，包含2×Probe qPCR Premix Ex Taq^TM25μL，ROX Reference DyeⅡ0.5μL，10μmol/L上下游引物EHP-qF66和EHP-qR66各3.0μL，10μmol/L TaqMan-MGB探针EHP-qP66 3.0μL，灭菌ddH₂O 10.5μL。

5.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述工作标准品为pMD18-T-SSU^EHP，浓度为1.0×10⁴～1.0×10⁸拷贝/μL，各200μL。

6.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述工作标准品pMD18-T-SSU^EHP的制备方法为：PCR扩增EHP DNA，经琼脂糖凝胶回收纯化后与pMD18-T连接，转化DH5α，得到重组质粒pMD18-T-SSU^EHP，并进行PCR及测序鉴定。

7.如权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为1.0×10⁵拷贝/μL的pMD18-T-SSU^EHP，所述阴性对照为不含EHP DNA的虾组织DNA溶液，各200μL。

8.权利要求1所述的引物组在制备检测虾肝肠胞虫的试剂盒中的应用，其特征在于，采用50μL反应体系，即45μL反应液加入5μL待检模板；待检样品与工作标准品、阳性对照、阴性对照、空白对照同时进行检测；荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火并延伸35s，扩增40个循环；在60℃结束时收集荧光信号；质量控制：建立标准曲线，其相关系数方值(RSq)应≥0.980；阴性对照和空白对照的Ct值应不显示，阳性对照的EHP DNA拷贝量应为1×10⁴～1×10⁶拷贝/μL，否则检测视为无效。