[发明专利]基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组和试剂盒

说明书

本发明公开了基于TaqMan‑MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组和试剂盒，属于病毒检测技术领域。具体包括检测虾肝肠胞虫(EHP)的引物和TaqMan‑MGB探针，以及基于上述检测引物和探针的试剂盒、检测方法。本发明设计特异性的引物及TaqMan‑MGB探针，制备了重组质粒标准品pMD18‑T‑SSU^EHP，建立检测EHP的TaqMan‑MGB探针荧光定量PCR方法，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点，适用于虾类样品的EHP定量检测，可为EHP快速定量检测及实时监测提供一种新的技术手段。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，更具体地说是涉及基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组和试剂盒。

背景技术

虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)属于肠胞虫科、肠胞虫属的一种专性细胞内寄生的微孢子虫，在2004年最早发现于泰国养殖的斑节对虾并于2009年首次被分离和正式命名报道，主要感染凡纳滨对虾和斑节对虾等重要养殖虾类，是近10年危害养殖对虾的主要病原之一。EHP可通过水平和垂直传播，但主要经口摄食寄生EHP的鲜活饵料、病虾、死虾或水体中的孢子体而感染。EHP感染主要导致养殖对虾生长缓慢甚至停滞，表现为对虾消瘦、大小不均、重量离散；还可导致患病虾肝胰腺遭到破坏，免疫力降低，更容易被其他病原所侵染而死亡，给对虾养殖业造成了严重损失。

研究发现，EHP感染数量与其危害密切相关，轻度感染基本上不影响对虾的生长发育，中度感染影响对虾营养吸收，严重感染损坏对虾免疫系统；但轻度感染虾会逐渐发展到重度感染。因此，建立一种快速、准确的EHP定量检测方法，在虾苗检疫、亲虾筛选及成虾养殖疫情监测中可根据EHP定量数据结合虾的大小和养殖模式制定相应的措施，对防控由EHP引起的虾病害具有重要的意义。

EHP感染前期无明显病症，需采用组织学方法或分子生物学方法等实验室手段检测才能确诊。EHP检测方法包括原位杂交、套式PCR、荧光定量PCR和环介导等温扩增(LAMP)等，但是这些方法在灵敏度和便捷程度上各有优缺点；特别是在EHP定量检测方面，目前采用的TaqMan探针定量PCR由于探针长度太长，敏感性不够理想。

目前国内尚未发布EHP检测的相关标准，而农业农村部在虾肝肠胞虫病(EHPD)监测计划中仍推荐采用套式PCR法进行检测。但在实际检测工作中，套式PCR法存在操作繁琐、检测时间长、不能定量等缺点，不能满足对EHP进行快速定量检测的需求。

因此，建立一种基于TaqMan-MGB探针的EHP荧光定量PCR检测方法，以提高EHP定量检测的灵敏度及效率是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了基于TaqMan-MGB探针的虾肝肠胞虫荧光定量PCR检测引物组和试剂盒。

荧光定量PCR相比普通PCR，其检测和分析过程在密闭的单管里由机器自动完成，具自动化程度高、有效解决PCR产物污染问题、能定量检测病原体感染的强弱等优点，在实验室检测病原体的方法选择上被认为是最理想的方法；TaqMan-MGB探针则是荧光定量PCR使用的一种荧光探针，其3′端的淬灭基团为不发光的MGB(Minor Groove Binder)结合物，可实现高Tm值的探针长度缩短易于与模板退火而利于提高方法的灵敏度，且探针3′端不发光的淬灭基团与5′端报告基团在空间的位置更接近，使荧光本底降低、实验结果分辨率更高。

本发明的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR法既能发挥荧光定量PCR法的优势而克服套式PCR法的缺点，且其探针连接MGB基团相对于TaqMan探针因长度缩短易于与模板退火而更有利于提高方法的灵敏度，非常适用于对灵敏度要求高的病原体定量检测，可提高EHP检测的敏感性和效率。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：