[发明专利]检测AML预后相关基因突变的引物组合物、试剂盒及其应用

说明书

本发明提供了检测AML预后相关基因突变的引物组合物、试剂盒及其应用，所述引物组合物包括检测FLT3‑ITD突变、FLT3‑TKD突变、NPM1突变和CEBPA突变的共6组引物对，各对引物相互配合，实现了对AML预后相关突变基因的全面检测，操作简单方便，灵敏度高、准确性好。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，涉及检测AML预后相关基因突变的引物组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一组以造血干细胞增殖失控、分化受阻、同时抑制正常造血功能为特点的异质性造血系统恶性疾病，包括多种具有不同遗传异常和临床特征的实体。AML患者的5年以上长期生存率不足50％，即使预后良好的患者也极易复发，复发后预后极差。随着研究的不断深入，发现基因突变是影响AML预后的关键因素之一。

WHO2008髓系肿瘤与急性白血病分类指南推荐对所有正常核型急性髓系白血病(CN-AML)患者进行NPM1、FLT3和CEBPA基因筛查；WHO2016分类指南将伴有NPM1基因突变的AML和伴有CEBPA基因突变的AML单独归为一类，纳入伴重现性基因突变的AML当中；2010年欧洲国际专家组公开的AML诊治方案认为临床工作应该进行NPM1、CEBPA和FLT3突变检测；成人急性髓系白血病(非APL)中国诊疗指南(2017年版)将FLT3-ITD、NPM1、CEBPA等基因突变列为分子学检测对象中的初级检查指标，作为急性髓系白血病(AML)分型和危险度分组的基础。

fms样酪氨酸激酶3(fms-like tyrosinekinase3，FLT3)基因突变是AML最常见的基因突变之一，主要包括FLT3跨膜区的内部串联重复突变(FLT3-ITD)和累及活化环中的点突变(FLT3-TKD)两种形式。伴有FLT3-ITD阳性的患者表现为较低的CR率、DFS、EFS和OS，具有独立的不良预后意义。

NPM1是一种广泛在核仁表达的磷蛋白质，定位于人类染色体5q35，含有12个外显子，编码由294个氨基酸组成的NPM蛋白。它可以在细胞核和细胞质之间穿梭，参与核糖体蛋白的组装和运输，调控中心体的复制以及肿瘤抑制因子ARF的表达。NPM1突变会导致蛋白从细胞核转移到细胞质，引起急性髓细胞白血病。NPM1基因突变是目前AML最常见的突变形式，NPM1突变在急性髓系白血病中通常被认为是预后良好的因素之一。

CCAAT增强子结合蛋白A(CEBPA)基因位于染色体19q13.1，全长3318bp，序列中无内含子。CEBPA是维持造血系统粒系分化的重要转录因子，在调节细胞增殖与分化中发挥着十分重要的作用。作为转录因子家族成员之一的髓系转录因子，CEBPA是髓系祖细胞增殖与分化过程中一个重要的转录因子，在诱导粒系分化和抑制细胞增殖方面具有重要作用，其功能的破坏、丧失常与AML的发生有关，恢复CEBPA表达可以作为诱导分化治疗手段。

目前，同时检测FLT3-ITD、FLT3-TKD、NPM1和CEBPA的技术主要有NGS技术、PCR+毛细管电泳技术、q-PCR技术、焦磷酸测序技术和琼脂糖凝胶电泳技术，但或多或少存在一些缺点：NGS技术检测周期长、花费高；PCR+毛细管电泳技术主要采用Sanger测序技术和片段分析技术，Sanger测序技术需要对每个位点单独操作，流程复杂，人力物力消耗大，片段分析技术也是对每个基因单独进行PCR扩增，单独上机或者混合上机，目前成熟的产品一般只包括1-2个基因，覆盖不全面；q-PCR技术通量小，不适用于多基因检测；焦磷酸测序技术操作过程复杂，通量小；琼脂糖凝胶电泳技术对短片段插入区分不明显，易出现假阴性结果。

目前国内外检测FLT3-ITD、FLT3-TKD、NPM1和CEBPA主要以DNA和RNA为操作对象，FLT3-ITD以RNA为操作对象会造成检测范围不全面，因为ITD突变包括内含子的插入。另外，RNA极易被污染和降解，逆转录效率低，影响检测灵敏度。

因此，有必要构建一种新的FLT3-ITD、FLT3-TKD、NPM1和CEBPA检测技术。