[发明专利]一种基于Type I-F CRISPR/Cas的染色质成像方法和染色质成像系统

说明书

本发明公开了一种基于Type I‑F CRISPR/Cas系统的染色质成像系统。本发明首次研究显示隶属于Type I‑F CRISPR/Cas系统的Cascade复合物，如PaeCascade复合物，能有效用于染色质成像；同时，本发明对Type I‑F CRISPR/Cas系统进行了哺乳动物表达系统优化，使得其在哺乳动物细胞内具有高效的双链DNA结合活性，并将荧光分子融合表达至优化后的Cascade亚基上，成功构建了染色质成像系统。本发明使得Type I‑F CRISPR/Cas系统在哺乳动物细胞的染色质成像方面的应用成为可能，并为基于Type I‑F CRISPR/Cas系统的染色质成像提供了必要工具。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种基于Type I-F CRISPRCas的染色质成像方法和染色质成像系统及应用。

背景技术

在真核细胞中，基因组DNA以染色质的高级形式储存于细胞核的三维空间内，因此称“三维基因组”。三维基因组结构的异常与多种人类疾病的发生密切相关。基因组的三维结构是一个动态变化，且呈现单细胞异质性的结构。因此在活细胞状态下，采用单细胞分辨率来研究基因组三维结构的动态和功能尤为重要。三维基因组领域有非常多重要科学问题等待探索。例如，一个特定基因在细胞核内的位置由什么分子决定？在哪些情况下，基因或调控元件会从细胞核的一个位置移动到另外一个位置？这种空间位置上的变化，是由哪些蛋白分子介导？这个发生位移的时间点是有规律并受某种机制控制的吗？这背后的生物学意义是什么？这一系列问题同样适用于三维基因组结构概念范畴里的任何一个方面，例如染色质环，拓扑关联结构域，染色体区室或染色体疆域等不同三维结构的形成。

近年来，活细胞DNA标记技术，作为研究基因组不可或缺的实时成像工具，受到了极大地关注。将核酸酶失活的Cas9，简称dCas9,与荧光蛋白融合，经过系统改造优化后，可在人的活细胞中标记并实时追踪特异基因或特异调控元件在细胞核内的位置及动态变化。该技术可以在细胞分裂各个时期的多种细胞类型内进行基因组DNA特异标记，并能对目标元件进行长达十几个小时的动态观察，显示了该项技术可广泛性运用的前景。如马来西亚博特拉大学Mahdi Moradpours实验室在期刊Plant Biotechnology Journal上发表的题为“CRISPR/dCas9 Platforms in Plants:Strategies and Applications beyond GenomeEditing”的综述中记载了CRISPR/dCas9在植物活细胞染色质成像中的应用。

虽然基于CRISPR-Cas9的活细胞DNA成像技术在最近几年得到了很大的发展，但是大部分工作还是局限于标记带重复序列的DNA片段。不含重复序列的基因标记还是存在很大的挑战。技术难点主要体现在：为了富集足够强的高于背景的信号，不含重复DNA序列的基因标记需要表达26-36个sgRNA。然而不同sgRNA的活性差异很大，虽然有不少预测sgRNA活性的设计软件帮助我们筛选靶点，但是仍然无法用之准确判断sgRNA在细胞内的活性，其标记效率比较低。

在自然界中，CRISPR/Cas系统拥有多种类别，和单效应蛋白的CRISPR相对，I型(Type I)CRISPR系统由多效应蛋白组成，需要多亚基共同组装成为具有功能的CRISPR复合体(CRISPR-associated complex for antiviral defense，Cascade)执行功能。从亚基数量和排列等基因特征进行归类，I型CRISPR又可细分为8种亚型(I-A到I-G型，I-U型)。以目前研究最深入的大肠杆菌的I-E型CRISPR系统为例，该系统由5种效应蛋白和CRISPR RNA(crRNA)构成，其组装首先需要Cas6对crRNA进行加工，其后Cas5、6个Cas7、Cas8e和2个Cse2小亚基共同被招募形成具有共11个亚基的复合体。该复合体仅具有双链DNA(dsDNA)结合能力，需要与Cas3结合才能进行dsDNA切割。