[发明专利]高效合成丙酮酸与D-丙氨酸的工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种高效合成丙酮酸与D-丙氨酸的工程菌，其特征在于，所述的工程菌是在大肠杆菌宿主中过表达氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的L-氨基酸脱氨酶，并在编码L-氨基酸脱氨酶的基因序列的N端插入N端编码序列；

所述的N端编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的大肠杆菌宿主为敲除btsT、cstA、aceEF、pflB、poxB、pps、ldhA基因的大肠杆菌BL21（DE3）。

2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述的工程菌以质粒pET20b为表达载体。

3.根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于，插入N端编码序列和L-氨基酸脱氨酶的质粒pET20b-N6-pm1-V437I的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.一种权利要求1~3任一项所述的工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）质粒pET20b-N6-pm1-V437I构建：设计定点饱和突变引物，以pET20b-pm1质粒为模板，全质粒PCR扩增，将PCR产物分别转入大肠杆菌BL21中，对饱和突变菌株进行高通量筛选，获得催化活力提高的BL21 pET20b-pm1-V437I菌株，提取质粒pET20b-pm1-V437I，设计N端融合引物，以该质粒为模板，PCR扩增后产物转入大肠杆菌JM109中，测序验证得到pET20b-N6-pm1-V437I质粒；

（2）工程菌构建：将质粒pET20b-N6-pm1 -V437I导入大肠杆菌宿主中，得到所述的工程菌。

5.一种权利要求1~3任一项所述的工程菌在合成丙酮酸中的应用，其特征在于，所述的应用是采用所述的工程菌全细胞催化D,L-丙氨酸生成丙酮酸和D-丙氨酸。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的工程菌是通过将工程菌接种至发酵培养基中，在25-37℃下培养，以0.005~0.02 mM的IPTG进行诱导10~15h，离心收集得到。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养基的配方为：蛋白胨10~15g/L，酵母提取物22~25 g/L，甘油3~5 g/L，磷酸氢二钾2.2~2.4 g/L，三水磷酸氢二钾16~17g/L。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的全细胞催化的条件为：底物D,L-丙氨酸浓度为110g/L，细胞浓度为4g/L，在30~40℃、100~300 rpm催化反应。