[发明专利]高效合成丙酮酸与D-丙氨酸的工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种高效合成丙酮酸与D‑丙氨酸的工程菌及其构建方法与应用。本发明在基因工程菌株BLK07(pET20b‑pm1)的基础上，通过定点饱和突变筛选到了pm1酶活提高的菌株，并通过在pm1基因序列N端插入N端编码序列(NCS)，提高了pm1的蛋白表达量，提高了丙酮酸的产量，显著缩短了催化时间，提高了催化效率。当底物D,L‑丙氨酸浓度为110g/L，细胞浓度为4g/L，催化体系在摇瓶中37℃、220rpm只催化8h时，丙酮酸的产量即可达到最大值46.5g/L，L‑丙氨酸的转化率为84.5％，D/L‑丙氨酸的拆分率达到84.5％。

技术领域

本发明涉及一种高效合成丙酮酸与D-丙氨酸的工程菌及其构建方法与应用，属于代谢工程技术领域。

背景技术

丙酮酸(Pyruvic acid)是药物合成领域的重要中间体，广泛应用于食品、农药、生化等工业中。目前工业上丙酮酸的生产方法主要有化学合成法，酶转化法和微生物发酵法。其中，化学合成法成本较高，而且其对于环境的污染较大；而微生物直接发酵法中，产物的成分复杂且分离难度大。生物催化法合成丙酮酸可以克服上述两种方法的不足和缺点，因此，在工业应用中具有广阔前景。

D-丙氨酸是生产维生素B6和泛酸钙的原料，具有镇痛作用，也可用作多种生化试剂和有机合成中间体。目前D-丙氨酸的价格比D,L-丙氨酸、L-丙氨酸都要高，然而D,L-丙氨酸的拆分困难，且成本较高。因此，寻找一种操作简单、成本低且效率高的D,L-丙氨酸的拆分方法很有意义。

L-氨基酸脱氨酶(EC 1.4.3.2)广泛存在于自然界各种生物中。每类L-氨基酸脱氨酶均对特定的一种或几种氨基酸或其氨基酸衍生物表现出较高的底物亲和性，而对其他氨基酸的亲和性较差。因此，不同来源的L-氨基酸脱氨酶具有高度保守性。Proteusmirabilis来源的L-氨基酸脱氨酶pm1，能催化L-丙氨酸生成丙酮酸，却几乎不催化D-丙氨酸，因此pm1可用于手性拆分D,L-丙氨酸。

大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)是一种可用于高效表达含T7启动子的表达载体的菌株，其遗传背景清晰，分子手段多样，是一种被广泛用作异源表达重要化学品合成途径的生产宿主。

分子对接是通过受体的特征以及受体和配体分子之间的相互作用方式来进行药物设计或蛋白分析的方法。主要研究分子间(如配体和受体)相互作用，并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法。近年来,分子对接方法已成为计算机辅助酶蛋白研究领域的一项重要技术。

有研究表明，N端编码序列对基因的表达有调节作用。因此，基于这些研究，可以通过在基因N端添加文献所构建的NCS库中对基因表达促进作用较强的编码序列，以筛选得到基因表达水平高的正向突变菌株。

此前，本人已在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了源于Proteus mirabilis的L-氨基酸脱氨酶来催化合成丙酮酸同时通过手性拆分D,L-丙氨酸获得D-丙氨酸。研究中发现，在全细胞催化的过程中，细胞本身会大量吸收并利用产物丙酮酸，使得丙酮酸产量较低。针对这一问题，本人已于之前的研究中敲除了E.coli BL21中的丙酮酸转运蛋白(cstA,btsT)基因，减少其在全细胞催化过程中对生成的丙酮酸的摄入。并通过敲除E.coli BL21自身消耗丙酮酸的基因aceEF、pflB、poxB、pps、ldhA，提高丙酮酸积累量。获得的基因工程菌株BLK07(pET20b-pm1)催化24h，生成丙酮酸的产量达到32g/L(专利申请号：201911385044X)。然而，该菌株催化时间长，产量距离工业化仍有一段距离。

因此，如何利用表达L-氨基酸脱氨酶pm1的大肠杆菌更高效的手性拆分D,L-丙氨酸转化合成丙酮酸，仍是本领域亟待解决的问题。

发明内容