[发明专利]猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测方法

权利要求书

1.用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包含3对特异性引物和3条探针，其中，3对特异性引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4和SEQ ID NO.5-6所示；3条探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-9所示；各引物和探针的工作浓度比为：SEQ ID NO.1所示引物、SEQ ID NO.2所示引物和SEQ ID NO.7所示探针的浓度比为1:1:1；SEQ ID NO.3所示引物、SEQ ID NO.4所示引物和SEQ ID NO.8所示探针的浓度比为1:1:2；SEQ ID NO.5所示引物、SEQ ID NO.6所示引物和SEQ ID NO.9所示探针的浓度比为1:1:2。

2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光基团为选自FAM、VIC、CY5、HEX、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种；所述探针的3’端标记淬灭基团为选自MGB、BHQ2、BHQ1、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

3.根据权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，3条探针的5’端标记荧光基团分别为FAM、VIC、CY5，3’端标记淬灭基团分别为MGB、BHQ2和BHQ2。

4.权利要求1~3任一项所述的引物探针组在制备用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的试剂盒中的应用。

5.用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1~3任一项所述的引物探针组。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，各引物和探针的工作浓度为：SEQ ID NO.1所示引物0.3µmol/L、SEQ ID NO.2所示引物0.3µmol/L、SEQ ID NO.7所示探针0.3µmol/L、SEQ ID NO.3所示引物0.2µmol/L、SEQ ID NO.4所示引物0.2µmol/L、SEQID NO.8所示探针0.4µmol/L、SEQ ID NO.5所示引物0.2µmol/L、SEQ ID NO.6所示引物0.2µmol/L、SEQ ID NO.9所示探针0.4µmol/L。

7.猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒的三重FQ-PCR的非诊断目的的检测方法，其特征在于，包括：提取待测样品的RNA，将待测样品的RNA反转录得到cDNA，以cDNA为模板利用权利要求1~3任一项所述的引物探针组，进行三重FQ-PCR检测，根据扩增反应结果判断待测样品中是否含有猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒。

8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述三重FQ-PCR检测的反应体系中引物和探针的工作浓度比为：SEQ ID NO.1所示引物、SEQ ID NO.2所示引物和SEQ ID NO.7所示探针的浓度比为1:1:1；SEQ ID NO.3所示引物、SEQ ID NO.4所示引物和SEQ ID NO.8所示探针的浓度比为1:1:2；SEQ ID NO.5所示引物、SEQ ID NO.6所示引物和SEQ ID NO.9所示探针的浓度比为1:1:2。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述三重FQ-PCR检测的反应体系中引物和探针的工作浓度为：SEQ ID NO.1所示引物0.3µmol/L、SEQ ID NO.2所示引物0.3µmol/L、SEQ ID NO.7所示探针0.3µmol/L、SEQ ID NO.3所示引物0.2µmol/L、SEQ ID NO.4所示引物0.2µmol/L、SEQ ID NO.8所示探针0.4µmol/L、SEQ ID NO.5所示引物0.2µmol/L、SEQ IDNO.6所示引物0.2µmol/L、SEQ ID NO.9所示探针0.4µmol/L。

10.根据权利要求8~9任一项所述的检测方法，其特征在于，所述三重FQ-PCR检测的反应程序如下：95℃ 30 s，1个循环；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环。