[发明专利]猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测方法

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ‑PCR检测方法。本发明提供用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的特异性引物和探针，并建立了猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒的三重FQ‑PCR检测方法。本发明的特异性引物、探针和检测方法的特异性强、灵敏度高、重复性好，为猪腹泻性疾病的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异的临床检测方法。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的引物组、与该引物组配套使用的探针组、试剂盒以及检测方法。

背景技术

目前，能够引起猪感染的冠状病毒有6种，其中PEDV、PDCoV、SADS-CoV和TGEV主要引起猪群腹泻，PRCV引起猪呼吸道症状，PHEV引起猪呕吐和神经症状。近年来，养猪业饲养方式向更加规模化和集约化转变，同时冠状病毒存在病毒重组进化，使得猪腹泻病的病因也变得越来越复杂。

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病。可感染各种年龄的猪，尤其对10日龄以内的仔猪危害最为严重，临床上常引起水样腹泻、呕吐和脱水等症状。PEDV为不分节段的单股正链RNA病毒，属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、α-冠状病毒属(Coronavirus)。

猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)和猪急性腹泻综合症冠状病毒(swine acute diarrhoea syndrome coronavirus，SADS-CoV)是近年来新发现的两种猪冠状病毒。PDCoV和SADS-CoV的基因组同为单股正链不分节段的RNA。PDCoV属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、δ-冠状病毒属(Coronavirus)；SADS-CoV属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、α-冠状病毒属(Coronavirus)。PDCoV和SADS-CoV所引起的临床症状类似于其他已知的猪肠道冠状病毒引起的临诊症状，包括严重且急性的呕吐和腹泻，新生仔猪体重迅速减轻导致急性死亡。

由于PEDV、PDCoV和SADS-CoV同属于冠状病毒，且感染猪只后可引起相似的临床症状，因此，难以从感染猪的临床特征和病原的形态上加以区分。而疫病病原的确定是疫病防控的关键一步，因此快速且灵敏地实施对于这三种腹泻病原的鉴别诊断尤为重要。

目前，对于SADS-CoV等猪腹泻类疫病检测的PCR方法主要分为两种：一种是以单个病原为检测对象的荧光PCR检测方法，这种方法不能快速确定病原种类，不利于准确了解疫病的流行动态，进行疫病防控；另一种是以多个病原为检测对象的普通PCR检测方法，这种方法操作繁琐,费时费力。

实时荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR，简称为FQ-PCR)具有敏感、快速、准确的特点，并且在核酸快速扩增的同时实现模板的定量测定。目前发展起来的多联实时荧光PCR技术可以在同一个PCR反应中，通过荧光基团分析来区分不同的核酸片段，为同时检测多种病原提供了技术基础。

发明内容

本发明的目的之一是提供用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的引物组、与该引物组配套使用的探针组，本发明的另一目的是提供猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的试剂盒以及检测方法。