[发明专利]一种高灵敏度和特异度的sdLDL-C比色法检测试剂盒及其制备使用方法

权利要求书

1.一种高灵敏度和特异度的sdLDL-C比色法检测试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分；

所述试剂R1包括的成分及相应含量为：MOPS缓冲液20~80 mM，PEG 6000 100~200 g/L，BSA 20~30 g/L，NaCl 1.8~18 g/L，NaN₃ 0.2~0.8 g/L，EDTA 0.1~1 g/L，过氧化氢酶500~900 U/L，胆固醇酯酶200~800 U/L，胆固醇氧化酶100~1000 U/L，TOOS 10~15 mM，表面活性剂I 0.05~0.1%，其溶剂为纯化水；

所述试剂R2包括的成分及相应含量为：MOPS缓冲液20~80 mM，PEG 6000 100~200 g/L，BSA 20~30 g/L，NaCl 1.8~18 g/L，NaN₃ 0.2~0.8 g/L，EDTA 0.1~1 g/L，4-AAP 0.5~2 mM，过氧化物酶10~20 U/L，mPEG-PlD 5~15 mg/L，表面活性剂II 0.05~0.8%，其溶剂为纯化水；

其中，所述试剂R1中的表面活性剂I由日光公司产品NIKKOL BT-9和NIKKOL BT-12中的一种或几种构成；所述试剂R2中的表面活性剂II由西宝公司产品Brij-35和DTAC中的一种或几种构成；

同时，所述mPEG-PlD的获取方法如下：

①重组磷脂酶D的制备：

a. 于GENBANK获取磷脂酶D全部CDS，于首尾分别添加BamHⅠ及EcoRⅠ酶切位点，即得目标序列，具体如SEQ ID NO.1所示；

b. 得到目标序列后，送基因公司合成；

c. 双酶切后连接至表达载体pET32a上，并导入到表达菌Ecoli；

d. 涂布于氨苄平板上，并挑取阳性菌进行发酵表达；

e. 离心取上清，过镍柱进行亲和层析，即得目的产物；

②重组磷脂酶D的mPEG化：

a. 将氰尿酰氯 5.5g、无水Na₂CO₃ 10g、分子筛5A 5g及mPEG-5000 50g溶于400 mL的无水苯中，常温下搅拌反应12 h；

b. 离心去除Na₂CO₃、分子筛5A悬浮物，用600 mL的乙醚沉淀，再用400 mL的无水苯溶解沉淀；如此沉淀、溶解反复5次，去除没有反应的氰尿酰氯，直至在258 nm波长下检测无光吸收；最后，进行真空干燥，即得活化的CC-mPEG；

c. 取上述CC-mPEG与步骤①制备的重组磷脂酶D，将二者溶解于10 mL硼酸盐缓冲液，于摇床室温反应3~6 h后，15 kD透析过夜，即得修饰酶液，记为mPEG-PlD。

2.根据权利要求1所述的高灵敏度和特异度的sdLDL-C比色法检测试剂盒，其特征在于，还包括sdLDL校准品；所述sdLDL校准品包括的成分及相应含量为：MOPS缓冲液20~80mM，BSA 20~30 g/L，sdLDL-C 5~15 mg/L，NaN₃ 0.2~0.8 g/L，其溶剂为纯化水。

3.根据权利要求2所述的高灵敏度和特异度的sdLDL-C比色法检测试剂盒，其特征在于，所述sdLDL-C的获取方法如下：配制肝素-Mg²⁺，其中，肝素浓度150 U/mL，Mg²⁺浓度90mmol/L；按10%添加量在上述肝素-Mg²⁺中加入50 mL人血清，混匀，室温静置15 min，然后在1500 g条件下离心30 min；取此上清液40 mL，并再加入4 mL肝素-Mg²⁺，混匀，室温静置15min；最后，再于1500g条件下离心30 min，此上清即为sdLDL-C产物。