[发明专利]异源表达纤维素酶基因CBH Ⅱ的毕赤酵母工程菌株及应用

权利要求书

1.构建一种异源表达纤维素酶基因CBHⅡ的毕赤酵母工程菌株的方法包括如下步骤：

(1)里氏木霉RNA和cDNA的获得：将-80℃的里氏木霉QM9414甘油管解冻后接种到PDA培养基平板。封口，30℃培养箱正置培养至长出绿色的孢子，接种于诱导培养基获得菌丝体，用试剂盒提取总RNA和反转录得到cDNA；

(2)目的基因的克隆：设计合理引物将6个组氨酸(His)密码子导入到目的基因片段中，利用PCR技术扩增出目的基因；

(3)构建表达载体：采用同源重组的方法，以Ppic9k质粒为载体，将CBHⅡ基因插入启动子AOX1下游，5’端酶切位点为EcoRⅠ，3’端酶切位点为NotⅠ,构建Ppic9k-CBHⅡ表达载体；

(4)获取重组菌株：(以里氏木霉cDNA为模板，通过PCR成功扩增出目的片段，经双酶切法成功构建了重组质粒pPIC9K-CBHⅡ)；以bglⅡ为Ppic9k-CBHⅡ表达载体的线性化位点，实现表达载体线性化，然后通过电转化转入宿主毕赤酵母中，通过MD平板、MM平板，YPD平板(含不同浓度浓度G418)，基因组PCR成功获得重组菌株P.pastoris-cbh2-8；

(5)重组菌株的筛选：利用含不同浓度的抗生素G418的YPD平板筛选含有高拷贝整合质粒的重组酵母菌株；

(6)诱导表达条件的优化：将菌株P.pastoris-cbh2-8接至BMMY(含0.5％甲醇)中诱导，29℃，280rpm，振荡培养。24h、48h、72h、96h、120、144、168取样，每次取样都会补充一定量的甲醇，通过测定酶活和蛋白含量以确定最佳的诱导时间；将重组菌株接至BMMY(含0.5％甲醇)中进行不同温度(24、26、28、30)℃诱导，280rpm，振荡培养，在最佳诱导时间取样，每24h补充一定量的甲醇，确定最佳诱导温度；将重组菌株接至含0.5％甲醇的发酵培养基BMMY中进行不同转速诱导，在最佳温度培养，最佳诱导时间取样，每24h补充一定量的甲醇，确定最佳诱导转速；

(7)重组菌株的诱导产酶：使筛选后的菌株在已优化的诱导表达条件中产酶；

(8)重组蛋白活性检测：利用刚果红-CMC方法检测重组毕节酵母是否分泌出具有活性的纤维素降解酶；利用SDS-PAGE检测重组蛋白是否为目的蛋白及其蛋白表达量；

(9)酶学性质分析：通过硫酸铵沉淀、镍柱纯化得到电泳纯水平的重组酶，在不同pH条件下测酶活，确定最适pH；在最适pH，不同温度条件下测定重组酶酶活，确定最适温度；在重组酶的最适pH和最适温度下，取不同浓度的底物CMC，测得相应的反应速度V，得到重组酶的动力学常数。

2.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达CBHⅡ基因的构建方法和权利要求2所述的目的蛋白CBHⅡ最佳诱导表达条件，其特征在于，优化了目的基因的引物序列，合理引入6个组氨酸(His)对应的密码子，以使得表达的目的蛋白中含组氨酸，通过镍柱对目的蛋白进行分离纯化，便于后续利用镍柱对重组蛋白酶酶学性质进行分析。

3.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达CBHⅡ基因的构建方法，其特征在于，菌株P.pastoris-cbh2-8经甲醇诱导168h，26℃，260rpm后，CBHⅡ酶活力可达6.07IU/mL得到较大产量的目的蛋白，便于后续目的蛋白的纯化。

4.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达CBHⅡ基因的构建方法，其特征在于，酶学性质测得CBHⅡ的最适pH为5.5、最适温度为60℃、Km值约3.1mg/mL，V_max值约214.3IU/mg得到重组酶的基本酶学性质与天然里氏木霉分泌酶的酶学性质相似，可代替里氏木霉天然分泌核心酶组分用于纤维素基质水解中。

5.根据权利要求1所述的一种毕赤酵母中异源表达CBHⅡ基因的构建方法，其特征在于，实现了纤维素酶蛋白CBHⅡ在毕赤酵母中的异源表达,提高了重组毕赤酵母菌在甲醇诱导发酵过程中的产酶效率,提升重组毕赤酵母菌的工业生产潜力。