[发明专利]异源表达纤维素酶基因CBH Ⅱ的毕赤酵母工程菌株及应用

说明书

本发明公开了两株异源表达纤维素酶基因CBHⅡ的毕赤酵母工程菌及其应用，所述的工程菌为Pichia pastoris‑cbh2，其于2019年8月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号分别为CGMCC No.18419。通过PCR方法从里氏木霉获得葡萄糖外切酶Ⅱ(CBHⅡ)，将其克隆并插入到毕赤酵母整合表达载体pPIC9K中，获得pPIC9K‑cbh2表达载体。并通过电转化将载体导入到毕赤酵母GS115中获得重组毕赤酵母菌株，用不同浓度的抗生素G418筛选含有高拷贝整合质粒的重组酵母菌株，并通过摇瓶发酵初步优化确定了最佳诱导条件，同时对纯化后的重组蛋白酶酶学性质分析。

技术领域

本发明涉及异源表达纤维素酶基因CBH Ⅱ的毕赤酵母菌株的构建及应用，属于纤维素酶基因工程技术领域。

背景技术

木质纤维素是一种丰富的可再生资源，其可以转化为多种生物能源和化学产品。将木质纤维素转化为燃料乙醇的研究正受到越来越多的关注。但是木质纤维素转化生产燃料乙醇过程中，酶制剂成本及酶解过程约占其生产成本的40％，所以降低纤维素酶生产成本或通过统合生物加工过程(Consolidated bioprocessing， CBP)整合酶解和发酵过程是提高木质纤维素乙醇生产经济性的重要手段。

纤维素酶是由多种酶系组成的复合酶系统，包括外切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。市场上大多数商业纤维素酶是由木霉菌和曲霉分泌的，如里氏木霉、康氏木霉与黑曲霉等。其中里氏木霉抗代谢抑制能力强，生产的纤维素酶具有较高的酶活性，已成为工业上应用最广泛的纤维素酶生产菌株。然而，里氏木霉的酶系中存在多种蛋白质，导致纤维素酶所占的比例不高，并且各纤维素酶的比例主要由其自身调控，很难进行人工控制。通过在酵母中表达外源基因生产纤维素酶不仅能够使酵母具备直接降解纤维素的能力，而且可以通过人工手段来调控酶的合成与分泌，有利于对纤维素酶的酶学性质和相互作用进行研究，从而进一步提高其酶活能力。

目前，重组蛋白表达系统主要有：大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、转基因植物或动物表达系统和体外翻译系统。其中，真核生物具有生长快、培养容易、遗传操作简单，同时还可以对表达蛋白进行加工、修饰和折叠等特点，因此真核生物的表达系统越来越受到重视和广泛应用。其中巴斯德毕赤酵母表达系统是最近发展起来的较为完善的、应用最广泛的甲醇营养型酵母表达系统。重组毕赤酵母菌株外源基因表达能力强，稳定性高，可以胞外分泌纤维素酶蛋白，并且自身分泌的蛋白成分极少有利于表达蛋白的分离纯化。

发明内容

本发明提供了一种重组表达CBH Ⅱ的毕赤酵母工程菌Pichia pastoris-CBH2。该菌的分类命名为巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，于2019年 8月26日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18419。本发明的目的是利用基因工程的技术手段，将里氏木霉的纤维素外切葡聚糖酶CBH Ⅱ基因转化入毕赤酵母中，构建毕赤酵母工程菌株。该菌株能高效表达纤维素外切葡聚糖酶CBH Ⅱ，为了提高重组菌株的产酶量，研究了摇瓶培养的诱导时间、温度、转速。并且对分离纯化后的蛋白酶进行了酶学性质分析。

本发明提供的异源表达纤维素酶基因CBH Ⅱ的毕赤酵母菌株系统具体步骤如：

(1)里氏木霉RNA和cDNA的获得：将-80℃的里氏木霉QM9414甘油管解冻后接种到PDA培养基平板。封口，置于30℃培养箱培养至长出绿色的孢子，接种于诱导培养基获得菌丝体，用试剂盒提取总RNA、反转录得到cDNA；

(2)目的基因的克隆：设计合理引物，将6个组氨酸(His)密码子导入到目的基因片段中，利用PCR技术扩增出目的基因；

(3)构建表达载体：采用同源重组的方法，以Ppic9k质粒为载体，将CBH Ⅱ基因插入启动子AOX 1下游，5’端酶切位点为EcoRⅠ，3’端酶切位点为Not Ⅰ，构建Ppic9k-CBH Ⅱ表达载体。