[发明专利]一种Slfn4缺失的动脉粥样硬化模型小鼠的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种Slfn4缺失的动脉粥样硬化模型小鼠的构建方法，其特征在于，先将ApoE^–/–小鼠的Slfn4基因敲除，获得F0代小鼠；再对F0代小鼠进行基因型鉴定选择Slfn4基因敲除的F0代ApoE^–/–背景小鼠，并将其与ApoE^–/–小鼠进行回交获得F1代Slfn4基因杂合子小鼠；最后将F1代Slfn4基因杂合子小鼠进行自交获得F2代小鼠，对F2代小鼠进行基因型鉴定筛选，获得Slfn4双等位基因敲除且ApoE双等位基因敲除的纯合子个体即为Slfn4基因敲除动脉粥样硬化模型小鼠；

所述F0代小鼠的获得是采用CRISPR/Cas9技术将ApoE^–/–小鼠的Slfn4基因敲除；

所述 F0代小鼠的获得包括以下步骤：

1)靶向小鼠Slfn4基因的sgRNA选择：CRISPR-Cas9系统中sgRNA作用位点位于Slfn4基因的2号外显子区，sgRNA作用位点DNA靶序列分别如下所示：

Slfn4-sgRNA1：5’- AGGTGCAGGATACCAGGCAA GGG-3’；

Slfn4-sgRNA2：5’- AAGCCGAATCAGAGAGGTCC GGG-3’；

Slfn4-sgRNA3：5’- CTCAGTTGAACTGAAAGCAG CGG-3’；

2)引物设计：根据步骤1）获得的sgRNA靶序列设计4条引物，引物序列如下所示：

Slfn4-IVT-1：5’-TTCTAATACGACTCACTATAGGAGGTGCAGGATACCA

GGCAAGTTTTAGAGCTAGA-3’；

Slfn4-IVT-2：5’-TTCTAATACGACTCACTATAGGAAGCCGAATCAGAGA

GGTCCGTTTTAGAGCTAGA-3’；

Slfn4-IVT-3：5’-TTCTAATACGACTCACTATAGGCTCAGTTGAACTGAA

AGCAGGTTTTAGAGCTAGA-3’；

Slfn4-IVT-4：5’-AAAAAAGCAC CGACTCGGTG CC-3’；

3)合成双链DNA片段：将步骤2）中的Slfn4-IVT-1、Slfn4-IVT-2、Slfn4-IVT-3分别与Slfn4-IVT-4配对，以pX330质粒为模板，进行聚合酶链式反应并对获得的DNA扩增产物进行纯化；

4)获得sgRNA和Cas9 mRNA：分别以步骤3）中双链DNA片段为模版，体外转录并纯化，获得sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3；以AgeI单酶切线性化的pST1374-Cas9质粒为模版，体外转录并纯化，获得Cas9 mRNA；

5)获得Slfn4缺失的F0代小鼠：将步骤4）获得的3个sgRNA和Cas9 mRNA等比例注射由ApoE^–/–小鼠精子和C57BL/6小鼠卵细胞体外受精产生的受精卵细胞，获得Slfn4基因敲除的受精卵细胞并其移植至假孕雌鼠，出生的小鼠即为Slfn4基因敲除的F0代小鼠。

2.根据权利要求1所述的Slfn4缺失的动脉粥样硬化模型小鼠的构建方法，其特征在于，Slfn4基因敲除小鼠的基因型鉴定的引物如下所示：

Slfn4-GeneTy-F：5’- TCGGAGAGAAGACTAGGGATTCA-3’；

Slfn4-GeneTy-R：5’- GCAGAAACAGTTTGAGGGAGG-3’。

3.根据权利要求2所述的Slfn4缺失的动脉粥样硬化模型小鼠的构建方法，其特征在于，采用琼脂糖凝胶电泳对Slfn4基因型进行分析。

4.利用如权利要求1所述的构建方法得到的Slfn4缺失的动脉粥样硬化模型小鼠在研究动脉粥样硬化疾病发生、发展方面的应用。

5.Slfn4作为药物靶标在筛选治疗动脉粥样硬化疾病药物中的应用。

6.Slfn4抑制剂在制备治疗动脉粥样硬化疾病药物中的应用。