[发明专利]一种Slfn4缺失的动脉粥样硬化模型小鼠的构建方法及其应用

说明书

本发明涉及一种Slfn4缺失的动脉粥样硬化模型小鼠的构建方法及其应用。本发明将Slfn4基因敲除通过CRISPR‑Cas9系统引入ApoE基因缺失遗传背景的动脉粥样硬化小鼠，回交和杂交后进行基因型筛选，获得了双基因缺失的纯合子模型小鼠ApoE^–/–Slfn4^–/–。Slfn4缺失动脉粥样硬化模型小鼠(ApoE^–/–Slfn4^–/–)较ApoE^–/–小鼠动脉粥样硬化斑块显著减少，症状显著减轻，表明Slfn4基因具有促进主动脉粥样硬化斑块形成的作用。针对Slfn4上述功能，Slfn4可以作为药物靶标筛选治疗动脉粥样硬化疾病的药物；Slfn4抑制剂能够用于制备治疗动脉粥样硬化疾病的药物。

技术领域

本发明涉及一种Slfn4缺失的动脉粥样硬化模型小鼠的构建方法及其应用，属于基因工程和遗传修饰技术领域。

背景技术

动脉粥样硬化为血管阻塞性疾病的主要原因，由其所致脑梗死、心肌梗死等是我国首要致残、致死性疾病。动脉粥样硬化的形成、发展与单核巨噬细胞密切相关，后者吞噬脂质形成泡沫细胞沉积于血管壁、释放细胞因子并招募免疫细胞形成慢性炎症，是动脉粥样硬化的病理基础。

慢性炎症是导致动脉粥样硬化的核心因素。免疫细胞不断迁移到血管壁，与脂质等共同聚集导致动脉粥样硬化斑块的形成。斑块破裂后血栓形成、从而导致脑梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病等致残、致死性后果。而动脉粥样硬化斑块中的免疫细胞主要是巨噬细胞，后者来源于循环血液中单核细胞，吞噬脂质后形成泡沫细胞。单核巨噬细胞对动脉粥样硬化形成的作用体现在两个方面：第一、动脉粥样硬化形成早期，血液中的单核细胞通过内皮间隙，在内膜下分化为巨噬细胞；巨噬细胞通过清道夫受体CD36结合并吞入氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)，酪氨酸激酶Lyn发生磷酸化，磷酸化的Lyn级联激活JNK1/2或Vav等，促进Ox-LDL摄取，导致细胞内脂质堆积，形成泡沫细胞。第二、进入内膜后，单核细胞在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)等因子作用下分化成两类巨噬细胞：经典促炎型(M1)和抑炎型(M2)巨噬细胞，分别集中于不稳定和稳定斑块中，并对动脉粥样硬化的病理进程发挥调节作用。二者在斑块中呈动态变化，巨噬细胞数量和分型影响斑块的进展。因此，减轻巨噬细胞脂质蓄积和炎症反应的调控措施对防治动脉粥样硬化性心血管疾病具有重要意义。

髓样分化因子Slfn4特异且高丰度表达于单核巨噬细胞，而单核巨噬细胞对动脉粥样硬化的有着关键影响，但Slfn4在高脂血症条件下对单核巨噬细胞的分化、泡沫细胞形成的作用还缺乏研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Slfn4缺失的动脉粥样硬化模型小鼠的构建方法，并通过该模型探索Slfn4基因在动脉粥样硬化疾病发生、发展中的作用，提供Slfn4作为靶标用于筛选治疗动脉粥样硬化疾病的药物以及Slfn4抑制剂在制备治疗动脉粥样硬化疾病药物中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种Slfn4缺失的动脉粥样硬化模型小鼠的构建方法：先将ApoE^–/–小鼠的Slfn4基因敲除，获得F0代小鼠；再对F0代小鼠进行基因型鉴定选择Slfn4基因敲除的F0代ApoE^–/–背景小鼠，并将其与ApoE^–/–小鼠进行回交获得F1代Slfn4基因杂合子小鼠；最后将F1代Slfn4基因杂合子小鼠进行自交获得F2代小鼠，对F2代小鼠进行基因型鉴定筛选，获得Slfn4双等位基因敲除且ApoE双等位基因敲除的纯合子个体即为Slfn4基因敲除动脉粥样硬化模型小鼠。

所述F0代小鼠的获得具体包括如下步骤：

1)靶向小鼠Slfn4基因的sgRNA的选择：CRISPR-Cas9系统中sgRNA作用位点位于Slfn4基因的2号外显子区，sgRNA作用位点DNA靶序列分别如下所示：