[发明专利]一种漆酶纳米电极固定化新方法

权利要求书

1.一种漆酶纳米电极固定化新方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1：准备材料和设备：材料包括菌株（齿毛菌（Cerrena unicolor ）5.1011、齿毛菌87613）、酶液，使用的部分实验仪器包括pH计、电热恒温水槽、高速冷冻离心机、漩涡混合器、电热鼓风干燥箱、紫外分光光度计、电子天平、分析天平、AKTA™ pure和移液枪，部分试剂包括ABTS（2,2’-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐）、邻苯二酚（Catechol）、愈创木酚（Guaiacol）、柠檬酸（C₆H₈O₇）、磷酸氢二钠（Na₂HPO₄）、无水乙酸（HAc）、无水乙酸钠（NaAc）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、浓盐酸（HCl），所用部分溶液包括0.5 mmol/L ABTS溶液、0.1 mol/L HAc-NaAc（pH 6.0）缓冲溶液、50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.0）、柠檬酸-Na₂HPO₄缓冲液（pH 2.0~8.0）；

步骤2：Lac2漆酶酶液的制备：将齿毛菌5.1011所产粗酶液按一级0-50%，二级50-90%进行分级沉淀，用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）溶解硫酸铵沉淀所得的蛋白，置于2 L50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中4℃过夜透析，每隔12 h更换50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0），AKTA系统清洗好后，用50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）的A液充满管路后装上HiTrap DEAE（5 mL）的阴离子交换层析柱并平衡柱子，将透析后的粗酶液用0.20µm的滤膜进行抽滤后上样于DEAE平衡好的交换柱，待完全进样后，用A液平衡柱子，用B液含1 mol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）洗脱蛋白，设置B液含量为15%，流速为1 mL/min，收集有酶活的洗脱液，对每管洗脱液进行酶活测定，高酶活组分为所要的Lac2漆酶，将其置于4℃冰箱中保存备用；

步骤3：LacB漆酶酶液的制备：使用AKTA设备进行阴离子交换柱纯化蛋白，A液为pH8.5的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液，B液为pH8.5，含1 mol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液，洗脱设置B液为10%，具体实验操作方法同2.2.1.1，合并阴离子交换柱酶活较高且较纯的组分，缓慢加入(NH₄₎₂SO₄并混合均匀，使其浓度为1 mol/L，使用AKAT系统进行疏水层析柱继续纯化蛋白，使用1 mol/L (NH₄)₂SO₄溶液平衡柱子后上样，用1 mol/L (NH₄)₂SO₄平衡柱子后，降低盐浓度洗脱蛋白，收集有酶活组分，并将LacB漆酶保存于4℃冰箱备用；

步骤4：电极和纳米材料的预处理：

玻碳电极预处理：将玻碳电极（GCE）先后用0.3 μm，0.5 nm 氧化铝（α-Al₂O₃）粉末在麂皮上打磨抛光玻碳电极直至其表面如镜子般，放入1mM Fe(CN)₆^3-/4-的0.1 M KCl溶液中，在-1.0~1.0V 范围内循环伏安扫描，其图像稳定且氧化还原电位差小于0,8V时即可；然后将玻碳电极依次在体积比为1:1的乙醇、硝酸、蒸馏水中分别超声清洗3min；最后在红外灯下烘干备用；

纳米材料预处理：分别称取0.5 mg的羧基多壁碳纳米管（COOH-MWCNTs）、氧化石墨烯（GO）和石墨烯（rGO）于1 ml蒸馏水中超声分散后，放置在磁力搅拌器上搅拌得到均一、稳定的黑色分散液；

步骤5：修饰电极的制备：纳米材料修饰电极分别为COOH-MWCNTs/Nafion/GCE、GO/Nafion/GCE和rGO/Nafion/GCE，制作方法为：将COOH-MWCNTs、GO或rGO分别与Nafion溶液混合搅拌均匀，最终使纳米材料的浓度都为0.25 mg/ml，Nafion溶液的含量为0.1%，溶液达到一个相对稳定的状态后，取7 μL该溶液滴涂到预处理过的玻碳电极表面，在室温下干燥后放入温度为4 ℃的冰箱中保存备用；

酶电极为Lac/Nafion/GCE和LacB/Nafion/GCE，电极制作方法为：相同酶活添加量的漆酶（Lac2或LacB）和0.1%的Nafion混合搅拌均匀，溶液稳定后取7 μL该溶液滴涂到预处理过的玻碳电极表面，在室温下干燥后放入温度为4 ℃的冰箱中保存备用；

材料与酶复合电极为Lac2/COOH-MWCNTs/Nafion，电极制作方法为：将COOH-MWCNTs、漆酶（Lac2）和0.1%的Nafion混合搅拌均匀，溶液稳定后取7 μL该溶液滴涂到预处理过的玻碳电极表面，在室温下干燥后放入温度为4 ℃的冰箱中保存备用。