[发明专利]一种双孢蘑菇血红素双加氧酶制备方法及其应用

权利要求书

1.一种1-辛烯-3-醇的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

（一）制备双孢蘑菇血红素双加氧酶反应液

（1）提取总RNA并反转录为cDNA备用

以双孢蘑菇菌丝为样品，提取总RNA，并反转录为cDNA备用；

（2）PCR扩增

设计PCR扩增用引物序列如下：

AbD-F：5’-TGGTGGTATCGAAGGTAGGCATATGATGTCCAAGAGGCTCTCTGGTATC-3’，

AbD-R：5’-TTTAAGCAGAGATTACCTATCTAGAAGCATCATACTGAATGG-3’；

以步骤（1）中所合成制备cDNA为模板，进行PCR扩增；

（3）制备重组表达载体pCold-TF-AbD

以质粒pCold-TF为原核表达载体，将步骤（2）的PCR扩增产物与质粒pCold-TF分别进行NdeI、XbaI双酶切，对回收的酶切产物利用T4 DNA连接酶进行连接，以构建重组表达载体pCold-TF-AbD；

（4）转化并诱导表达

采用化学转化法，将步骤（3）的重组表达载体pCold-TF-AbD转化大肠杆菌BL21，随后，将转化正确的重组菌株在LB培养基中，培养扩增并加入IPTG诱导剂以进行诱导表达；

（5）制备反应液

诱导表达结束后，取菌液，离心并将菌体重悬于PBS buffer中，细胞破碎，获得细胞上清液作为反应液；

（二）制备1-辛烯-3-醇

将步骤（一）中所制备反应液与亚油酸按体积比1:1混合均匀后，密封、25℃静置反应2h。

2.双孢蘑菇血红素双加氧酶在1-辛烯-3-醇制备中的应用，其特征在于，基于基因工程技术在大肠杆菌中进行异源表达制备双孢蘑菇血红素双加氧酶时，IPTG诱导表达结束后，以细胞破碎后上清液作为反应液；

所述双孢蘑菇血红素双加氧酶的编码基因序列如SEQ ID No. 1所示。