[发明专利]一种双孢蘑菇血红素双加氧酶制备方法及其应用

说明书

本申请属于双孢蘑菇基因工程技术领域，具体涉及一个双孢蘑菇血红素双加氧酶及其应用专利申请事宜。利用已知的真菌血红素双加氧酶的氨基酸序列，通过与双孢蘑菇基因组序列比对，本申请获得了一个双孢蘑菇的血红素双加氧酶，该酶具有CYP域，与构巢曲霉的PpoC的氨基酸序列同源性为33%，相似性为51%，但该酶的CYP域和PpoC一样，不含有完整的P450特征的共有序列血红素保守结合区，推测该酶的CYP域也可能没有功能，将其命名为AbDOX‑(CYP)。进一步对该基因的克隆及大肠杆菌转化表达表明，该酶能够催化亚油酸合成1‑辛烯‑3‑醇。基于此证据，可为1‑辛烯‑3‑醇的进一步产业化生产改进奠定良好的技术基础。

技术领域

本申请属于双孢蘑菇基因工程技术领域，具体涉及一个双孢蘑菇血红素双加氧酶及其应用专利申请事宜。

背景技术

1-辛烯-3-醇（1-octen-3-ol）又称蘑菇醇，是食用菌的特征香味物质，具有青香、壤香、蜡香和未成熟的果香及牛奶风味，常应用于各种食品包括饮料、糖果、冰制食品、烘烤食品、调味品及烟用香精，尤其是用于各类食用菌加工的食品中。此外，1-辛烯-3-醇还是蚊子的引诱剂，广泛用于绿色驱蚊产品的生产应用中；另有研究表明，1-辛烯-3-醇对多种霉菌孢子的萌发和霉菌毒素的合成具有较强的抑制作用，并对植物害虫赤拟谷盗（ Tribolium castaneum）具有很强的毒性，因而在储粮、饲料贮存和害虫防治等方面也有广阔的应用前景。

1-辛烯-3-醇有2种光学异构体，天然的（−）异构体比（+）异构体具有更典型香味，呈典型的蘑菇香气，具有高的生物活性，而（+）异构体则表现为发霉的味道，生物活性低。人工合成制备的1-辛烯-3-醇是2种异构体的混合物，因此不能较好满足实际应用需要；生物自然合成的1-辛烯-3-醇主要是（−）异构体，也是目前生产制备的1-辛烯-3-醇常用的方法。

尽管多种动植物和微生物都能合成生产1-辛烯-3-醇，但从材料来源和安全性等方面考虑，以利用食用菌子实体或菌丝来源的酶催化多不饱和脂肪酸生产1-辛烯-3-醇，是最具经济性和竞争力的生产方法。研究表明，利用双孢蘑菇（ Agaricus bisporus）子实体催化生成1-辛烯-3-醇时，天然的（ −）异构体比例最高，可达98.5%以上，加上双孢蘑菇子实体催化合成1-辛烯-3-醇产量较好，因此是生物合成1-辛烯-3-醇的首选材料。

应用双孢蘑菇生产制备1-辛烯-3-醇的工艺过程为：在4℃条件下（避免酶被蛋白酶所降解）将子实体匀浆，然后在7.5℃条件下，以子实体匀浆为酶源，酶解多不饱和脂肪酸如亚油酸，从而生成1-辛烯-3-醇。

1-辛烯-3-醇作为多不饱和脂肪酸氧化的产物，其生物转化过程主要是利用双加氧酶（Dioxygenase）来实现，利用双加氧酶的催化作用在多不饱和脂肪酸分子内加上1个氧分子，从而生成多不饱和脂肪酸加氧产物。已知的双加氧酶可分为2类，分别是不含血红素的脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）和含有血红素的双加氧酶（Heme dioxygenase）。LOX催化多不饱和脂肪酸加上分子氧生成含有共轭双烯的氢过氧化物。血红素双加氧酶则催化多不饱和脂肪酸加氧生成无共轭双烯的氢过氧化物。

虽然利用双胞蘑菇子实体生产1-辛烯-3-醇的生产工艺已经较为成熟，但从进一步提高生产效率和改善生产质量角度而言，鉴定和制备双孢蘑菇中用于生物合成1-辛烯-3-醇的特定双加氧酶，对于进一步改善和提高规模化制备1-辛烯-3-醇具有十分重要的技术意义。

发明内容

本申请目的在于提供一种双孢蘑菇血红素双加氧酶制备方法，从而为利用双孢蘑菇产业化生产制备1-辛烯-3-醇时奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一对PCR扩增双孢蘑菇血红素双加氧酶编码基因的引物对，引物序列如下：