[发明专利]一种非标记型适配体探针体系及其检测方法和应用

说明书

本发明提供一种非标记型适配体探针体系及其检测方法和应用，属于生物检测分析技术领域。本发明采用SYBR Green I荧光染料对互补碱基进行染色，进行非标记型适配体探针体系的设计，不仅实现信号放大，且成本更加低廉；通过引发链的设计能够引发四种发夹形成大量的四臂连接体，以产生更多的互补配对碱基，可与更多SYBR Green I结合，在减少信号泄露的同时，实现信号的循环放大；同时基于T7核酸外切酶特性，从而对实验中未引发的发夹酶解，降低了背景信号干扰，提高了CAP检测的灵敏度，具有良好的实际应用之价值。

技术领域

本发明属于生物检测分析技术领域，具体涉及一种非标记型适配体探针体系及其检测方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

氯霉素(CAP)是一种从委内瑞拉链霉菌(Streptomyces venezuel)中得到的中性硝基苯衍生物。通常作为一种兽药用来治疗和预防各种病菌引起的感染。然而，CAP在带来益处的同时还潜伏着许多危险，如再生障碍性贫血、白血病和灰色婴儿综合征的产生。因此，基于对人们健康的考虑众多国家和地区都对CAP有了严格的限制和管控。例如，欧盟规定牛奶、肉类和海鲜中的CAP最大残留量为0.3μg/kg。中国规定在动物性食品中CAP不得检出。目前已经开发出众多检测CAP的方法，主要包括微生物学方法，酶联免疫吸附测定(ELISA)，液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)，高效液相色谱(HPLC)和免疫测定。但是这些方法都存在一定的不足。例如，微生物方法灵敏度低且特异性差，而色谱方法需要昂贵的仪器并且很耗时。尽管免疫测定方法具有良好的敏感性和高特异性，但抗原和抗体难以获得，检测复杂，结果易受基质干扰，导致假阴性和假阳性。因此，迫切需要一种简单，快速且低成本的方法来灵敏地测定动物组织中的CAP。

核酸适配体作为一种新型识别元件，对目标分子具有高亲和力，具有稳定性好，目标广泛，易于合成，修饰方便等优点，是一种优良的抗体替代识别元件。标记型适配体探针用于检测具有显而易见的优势。但发明人发现，所用到的FAM、Cy5等荧光基团需提前进行适配体修饰，可能导致适配体与待测物亲和力不足、结合过程受阻等问题。而无标记适配体利用荧光核酸染料代替荧光团标记，避免了复杂的修饰过程，具有操作简单，成本低的优点。SYBR Green I是一种结合于所有DNA双链双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在溶液中仅存在游离单链时，SYBR Green I发出微弱的荧光，而当其与双链结合时，荧光增强。

发夹自组装反应(CHA)是常用的分子检测方法，主要包括引发链和两个发夹型探针，可以形成大量的双链结构，从而达到信号放大的目的。CHA反应不仅可以提高检测的灵敏度，还能够根据设计生成不同构型的组装体。然而，发明人发现，在反应过程中伴随着双链产生的同时，还会存在信号泄露的不足。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明目的在于提供一种非标记型适配体探针体系及其检测方法和应用。本发明采用SYBR Green I荧光染料对互补碱基进行染色，进行非标记型适配体探针体系的设计，不仅实现信号放大，且成本更加低廉；设计四个DNA发夹和相应的引发链，引发链可引发四种发夹的自主装反应，形成大量的四臂连接体，以产生更多的互补配对碱基，可与更多SYBR Green I结合，在减少信号泄露的同时，实现信号的循环放大；另外体系中引入T7核酸外切酶，基于T7核酸外切酶特性，酶解实验中的双链结构与未引发的发夹，降低了背景信号干扰，提高了CAP检测的灵敏度。因此，该方法具有良好的实际应用之价值。

本发明的技术方案为：

本发明的第一方面，提供一种非标记型适配体探针体系，所述非标记型适配体探针体系至少包括引发链、适配体、发夹结构和T7核酸外切酶；

其中，所述引发链和适配体能够发生互补形成双链结构；

所述适配体为待测物对应的适配体；