[发明专利]一种表达繁殖与呼吸综合征病毒免疫原蛋白的酿酒酵母构建方法及其融合蛋白

说明书

本发明提供了一种表达繁殖与呼吸综合征病毒免疫原蛋白的酿酒酵母的构建方法，包括以下步骤，步骤1：猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)抗原蛋白筛选；步骤2：PRRSV抗原蛋白酵母表达载体构建；步骤3：PRRSV抗原蛋白酵母表达菌株的构建及筛选；步骤4：PRRSV抗原蛋白酵母表达菌株的鉴定，所述PRRSV抗原蛋白基因包括GP2和/或GP5蛋白基因。本发明还提供了构建的酵母菌株所表达的PRRSV抗原蛋白及一种融合蛋白，所述融合蛋白包含有GP2/GP5和AGA2蛋白。所述PRRSV抗原蛋白及所述融合蛋白稳定展示于酵母菌株表面，具有与天然蛋白更加接近的蛋白结构和特性，有利于进一步的利用所得蛋白。

技术领域

本发明属于蛋白表达及制备领域，尤其涉及重组蛋白在酿酒酵母体系的表达。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又被 称为猪神秘病(Mystery swine disease，MSD)、猪蓝耳病(Blue-ear Disease)、猪地方性 流产和呼吸综合征(Porcine epidemic abortion and respiratory syndrome，PEARS)，是 由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus， PRRSV)引起的一种传染性疾病。患有此疾病的猪会出现高烧、腹泻等症状，患病还会导致母 猪流产，新生及断奶后的仔猪则会出现呼吸急促、生长缓慢等现象，死亡率极高。

有关PRRS的报道最早出现于1987年的美国。其后，PRRS屡次在欧洲大陆和美洲流行， 曾有多个国家暴发过严重疫情，疫情给欧洲养猪业造成了严重损害。朱金海(2019)曾用RT-PCR 检测了112份疑似PRRSV感染样品，并对其中部分PRRSV毒株的ORF5和Nsp2基因构建了系 统进化树。结果发现近年来不同类型PRRSV毒株均出现了不同程度、不同模式的变异。由于 病毒高度变异，原有疫苗效价降低，高致病性猪繁殖与呼吸综合征现已成为我国养猪业的主 要威胁之一。

PRRSV属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属，病毒粒子呈球形或椭球形，直径约为50-60纳 米，外观较为光滑。病毒的基因组RNA由核衣壳蛋白包裹。在核衣壳周围，表面糖蛋白(GPs) 和膜蛋白插入到脂质双层膜中，形成病毒粒子。PRRSV基因组RNA为正链3’-聚腺苷酸分子， 大小约15kb，包含11个已知的开放阅读框(ORFs)。基因组3’端包含8个相对较小的基因， 除2型PRRSV的ORF4/ORF5外，这些基因与邻近基因均有5’端和3’端序列的重叠。这些相对较小的基因编码了四种膜相关糖蛋白(GP2a、GP3、GP4和GP5)，三种非糖基膜蛋白(E、ORF5a和M)，以及一种核衣壳蛋白(N)。GP2a是PRRSV结合细胞受体的重要蛋白，ORF5编 码的GP5蛋白是重要的中和性抗原，在不同分离株高变的32-34，38-39，57-59，137，151aa 处具有关键中和表位。

PRRSV目前有商品化的弱毒活苗及灭活苗，也有DNA及亚单位疫苗的应用报道，但均不 能有效控制PRRSV的感染。

灭活苗的优势在于制备简单、安全性高，但其诱发机体产生免疫功能的效果较差，需要 大量接种、多次接种，而接种量过大又可能引起动物应激反应而对动物产生伤害，因此灭活 苗在实际养殖过程中使用并不广泛。弱毒活疫苗则能够迅速诱导动物产生免疫保护，不仅能 使机体产生针对同源毒株的免疫作用，还能产生针对异源毒株的免疫效果，同时还有用量小、 成本低等优势，在养猪业中被广泛运用。然而弱毒活疫苗也存在着毒性增强和引起病毒基因 重组等风险，在具体使用过程中须受到限制。DNA及亚单位疫苗利用真核表达系统，表达PRRSV 的主要结构蛋白GP5、M、N，纯化后可对动物进行接种，能够弥补传统疫苗存在的缺陷，但 目前DNA及亚单位疫苗的使用还很少，相关技术仍需要科研工作者们进一步的研究和推动。