[发明专利]一种基于itraq技术获得高通量宏蛋白质组的定量分析方法

权利要求书

1.一种基于itraq技术获得高通量宏蛋白质组的定量分析方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

(1)总蛋白提取：

1)取菌体混合物至1.5mL EP管中，加入400uL裂解液；

2)使用细胞破碎仪超声处理，整个超声过程将样本置于冰水混合物中，以防超声过程产热使样本温度增高；

3)进行离心处理，控制离心转速为12000r/min，离心20min，取上清，即获得总蛋白液；

(2)蛋白酶解处理：

1)使用改良型Bradford蛋白质检测试剂盒检测总蛋白液中蛋白浓度，每份样本各取100μg蛋白，使用裂解液定容至相同体积备用；

2)蛋白样本中加入二硫苏糖醇使其浓度为10mM/L,然后置于37℃温度环境下还原30-60min；

3)取出蛋白样本加入碘乙酰胺使其浓度为25mM/L，然后置于暗处室温反应15-30min进行烷基化处理；

4)烷基化结束后，加入100mM/L TEAB使蛋白样本中Urea的摩尔浓度小于2M/L，再用胰蛋白酶进行二步法酶切，第一次酶切加入胰蛋白酶的量与蛋白质的质量比为1:50，37℃反应16h；第二次酶切加入胰蛋白酶的量与蛋白质的质量比为1:100，37℃反应4h；

(3)脱盐处理：

对酶解后的蛋白样本，使用Strata X SPE柱子脱盐，具体操作是：

1)活化：用1ml甲醇活化柱子；

2)平衡：用1ml水平衡柱子；

3)上样：将蛋白酶解液过柱子；

4)清洗：用1ml 10％甲醇清洗柱子；

5)洗脱：用0.5ml洗脱液洗脱肽段，重复洗脱步骤一次，收集两次洗脱的肽段液，然后使用台式冷冻真空浓缩仪真空干燥收集的肽段洗脱液；

(4)肽段同位素标记处理：

将步骤(3)真空干燥后的肽段溶解在20μL 500mM TEAB中，使用8-plex iTRAQ试剂进行标记，标记完成后，再使用真空浓缩仪进行真空干燥；

(5)肽段馏分分离处理：

对步骤(4)真空干燥后的标记肽段用HPLC溶液A溶解，将不同标记肽段进行混合获得上样液，再用Waters Bridge Peptide BEH C18高pH反相柱结合Waters HPLC e2695/2998色谱仪进行肽段分离，将收集的肽段液，使用真空浓缩仪进行真空离心干燥；最后用1.5mL EP管收集肽段组分，每管收集1mL，共收集34管，真空抽干进行后续质谱鉴定；

(6)肽段质谱鉴定：

将液相分馏得到的34管肽段组分分别溶于15μl nanoLC A液，每管样品取5ul，合并成20管样品，进样2ul，通过分析柱梯度洗脱进入Q Exactive组合式质谱仪鉴定；

(7)质谱数据搜库：

使用Proteome Discoverer 1.3软件将Q Exactive对肽段鉴定的原始图谱文件提交至SEQUEST软件进行数据库检索，获得高度可信的定性结果。

2.根据权利要求1所述的一种基于itraq技术获得高通量宏蛋白质组的定量分析方法，其特征在于，步骤(1)操作1)中所述的裂解液是由8M Urea、10mM DTT、2mM EDTA和1mM PMSF组成。

3.根据权利要求1所述的一种基于itraq技术获得高通量宏蛋白质组的定量分析方法，其特征在于，步骤(1)操作2)中所述的超声处理的条件为：功率30％，以超声2s后停止4s的循环方式处理，控制总工作处理时间为3min。

4.根据权利要求1所述的一种基于itraq技术获得高通量宏蛋白质组的定量分析方法，其特征在于，步骤(2)操作2)中所述的二硫苏糖醇的浓度为1M/L；操作3)中所述的碘乙酰胺的浓度为0.5M/L。

5.根据权利要求1所述的一种基于itraq技术获得高通量宏蛋白质组的定量分析方法，其特征在于，步骤(3)操作5)中所述的洗脱液为含有FA质量分数为2％的乙腈溶液。