[发明专利]一种基于itraq技术获得高通量宏蛋白质组的定量分析方法

说明书

本发明公开了一种基于itraq技术获得高通量宏蛋白质组的定量分析方法，属于宏蛋白质组学技术领域，具体包括如下步骤：(1)总蛋白提取、(2)蛋白酶解处理、(3)脱盐处理、(4)肽段同位素标记处理、(5)肽段馏分分离处理、(6)肽段质谱鉴定、(7)质谱数据搜库。本发明分析方法整体工艺搭配合理，步骤相对简单，能够高效稳定的提取宏蛋白，并能准确快速的进行搜库分析，获得高通量宏蛋白质组数据信息，增进了人们对微生物招募，营养资源竞争，代谢活性和防御系统在整个群落中分布的了解。

技术领域

本发明属于宏蛋白质组学技术领域，具体涉及一种基于itraq技术获得高通量宏蛋白质组的定量分析方法。

背景技术

现代分子生物学揭示，自然界中微生物群落远比人们预期的复杂和多样，大量的不可培养微生物是潜在的资源宝库，如何认识这些不可培养微生物以及如何对其利用是值得研究者深入思考的问题。

早期环境微生物研究主要依赖于纯培养技术，依靠纯培养技术所进行的研究揭示了一些有关环境微生物的组成及其多样性的信息。但是，环境微生物仅有一小部分可培养，其余大多数为未培养微生物，宏基因组学的出现弥补了部分传统的研究方法所存在的局限性。

宏组学(Meta-Omics)是涵盖宏基因组学、宏转录组学和宏蛋白质组学的一门学科。其中宏基因组研究可以获知环境中微生物的物种组成，目前已经开展的如火如荼；宏蛋白组描述环境中微生物的蛋白表达，由于其研究的复杂性，目前还处于起步阶段，但蛋白水平的研究可以进行微生物群落的一致性、活性和功能分析，能够提供宏基因组无法获取的信息。

宏蛋白组学(Metaproteomics)是由Paul和Philip二人在2004年首先提出，是应用蛋白质组学技术对微生物群落进行研究的一项新技术，其定义为在特定的时间对微生物群落的所有蛋白质组成进行大规模鉴定。

宏蛋白质组学是近年来新出现的一种概念和研究技术，虽然现在已经开展的宏蛋白质组学的研究很少，但是在特殊极端环境中功能基因表达、特殊功能蛋白质的开发、生态元素循环等研究领域，宏蛋白质组学已经初步展示了其强大的功能。

2005年，美国一项针对切萨皮克海湾(Chesapeake)的蛋白质组学研究，被认为是第一个研究纯天然环境的宏蛋白质组学工作，研究者利用滤膜收集了海湾不同水域的微生物群落，利用2D电泳展示了其蛋白质组，并通过质谱方法鉴定了部分蛋白。

在过去的十年中，通过将宏蛋白质组学应用于各种微生物群落，研究人员已经洞悉了不同环境微生物的关键功能特性。对宏蛋白质组数据集的分析提供了有关微生物群落的结构，功能和动态的信息，这对于增进对微生物招募，营养资源竞争，代谢活性和防御系统在整个群落中分布的了解至关重要。

宏蛋白质组研究存在的难点主要包括三个方面：样品制备、质谱检测、数据搜索。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于itraq技术获得高通量宏蛋白质组的定量分析方法；先进行总蛋白的提取，然后酶解蛋白获得肽段，iTRAQ标记肽段，高效液相色谱分馏及利用数据依赖性采集(DDA)扫描模式获取液相串联质谱下机数据，进行数据库检索。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案实现的：

一种基于itraq技术获得高通量宏蛋白质组的定量分析方法，具体包括如下步骤：

(1)总蛋白提取：

1)取菌体混合物至1.5mL EP管中，加入400uL裂解液；

2)使用细胞破碎仪超声处理，整个超声过程将样本置于冰水混合物中，以防超声过程产热使样本温度增高；

3)进行离心处理，控制离心转速为12000r/min，离心20min，取上清，即获得总蛋白液；

(2)蛋白酶解处理：