[发明专利]一种重组红霉素工程菌及其构建方法和筛选方法和应用

说明书

本申请公开了一种重组红霉素工程菌及其构建方法和筛选方法，以及所述重组红霉素工程菌在生产红霉素中的应用。所述重组红霉素工程菌是在红霉素产生菌中同时过量表达sucA基因和sucB基因所得。尤其是，所述重组红霉素工程菌是在红霉素高产菌HL3168‑E3中同时过量表达sucA基因和sucB基因所得。相较于红霉素高产菌HL3168‑E3，本申请所述重组红霉素工程菌在基础培养基培养后，发酵液中红霉素的浓度提高了40％，红霉素的浓度达到700mg/L。

技术领域

本申请涉及红霉素生物合成技术领域，尤其涉及一种重组红霉素工程菌及其构建方法和筛选方法，以及该重组红霉素工程菌在生产红霉素中的应用。

背景技术

红霉素(Erythromycin，Er)是由红霉素高产菌株红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)合成的次级代谢产物。在工业发酵生产中，红霉素的生产单位远低于青霉素等其他抗生素浓度，在老药新用及确保国家完整产业链的背景下，提高红霉素产量仍具有重要的战略意义。

在现有技术中，工业上提高合成红霉素产量的常规手段为：采用诱变育种技术对工业红霉素产生菌进行改造，然后经过多轮筛选获得高产红霉素的红霉素产生菌突变株进行工业发酵生产。例如，红霉素高产菌S.erythraea HL3168-E3(或称红霉素高产菌HL3168-E3)为诱变获得的高产红霉素工业菌株。但是，一方面，采用诱变育种技术改造红霉素产生菌往往需要耗费大量劳动力，并且诱变所得菌稳定性差，其生理性状经多代培养之后可能发生改变；另一方面，由于诱变育种多是随机诱变，所以筛选获得的高产突变株可能存在过度诱变的问题，即：包含若干个本质上不利于红霉素产量提高的突变。此外，现有技术中存在利用代谢工程技术提高红霉素产生菌生物合成红霉素产量的策略，其多聚焦于两点：1、采用基因工程技术，提高红霉素前体的积累，进而提高红霉素的浓度；2、通过转录调控的控制技术，以提高红霉素生物合成基因簇的转录，进而提高红霉素的浓度，但是只有极少数策略在工业菌株中得到有效验证。

随着核酸测序技术的快速发展，比较组学技术逐渐被应用于发掘提高工业微生物合成次级代谢产物的研究中，具有全面、有效、靶向精准度高的优点。但目前，尚无应用比较组学的定向代谢策略来提高红霉素的生物合成产量。

发明内容

本申请实施例提供了一种重组红霉素工程菌及其筛选方法与在生产红霉素中的应用，通过比较组学的定向代谢策略来预测与红霉素产量相关的基因，将所述与红霉素产量相关的基因作为改造靶点，构建多个工程菌，然后通过发酵试验筛选重组红霉素工程菌，从而有效提高红霉素的生物合成产量。

根据本申请的一方面，提供一种重组红霉素工程菌，是在红霉素产生菌中同时过量表达sucA基因和sucB基因所得，所述sucA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述sucB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

根据本申请的另一方面，提供上述重组红霉素工程菌在生产红霉素中的应用。在一些实施例中，所述应用为：使用上述重组红霉素工程菌发酵生产红霉素，以提高红霉素的生物合成产量。

根据本申请的另一方面，提供上述重组红霉素工程菌的构建方法，包括步骤：

构建重组质粒pIB-sucB：以红霉素产生菌的基因组作为模板，以引物1和引物2进行PCR扩增，获得sucB基因的扩增片段；将所述sucB基因的扩增片段连接至含启动子ermE*p的质粒载体中，获得重组质粒pIB-sucB；

构建重组质粒pIB-sucBA：以红霉素高产菌的基因组作为模板，采用引物对引物3和引物4进行PCR扩增，获得sucA基因的扩增片段；将所述sucA基因的扩增片段连接至所述重组质粒pIB-sucB中，获得重组质粒pIB-sucBA；以及，