[发明专利]蛋白质电泳染色液、试剂盒及染色方法

说明书

本发明公开了一种蛋白质电泳染色液，该染色液中包含有考马斯亮蓝、浓盐酸和水。本发明还公开了用该染色液进行蛋白质SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳条带染色的方法。本发明通过改进蛋白质电泳染色液的配方，提升了蛋白质电泳条带染色的效果，加快了染色、脱色速度，同时确保了染色液对人体的安全性，特别适合用于SDS‑PAGE或非变性PAGE等蛋白凝胶的无污染、快速、高灵敏染色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测。

技术领域

本发明涉及生物领域，特别是涉及蛋白质电泳，更具体地说，是涉及蛋白质电泳条带染色液的配方，及使用该染色液进行染色、脱色的方法。

背景技术

聚丙烯酰胺凝胶电泳技术是目前分析蛋白质组分和检测的最基本方法，可以分离蛋白并测定蛋白质的相对分子量和蛋白纯度，还可以用于蛋白的分离纯化。聚丙烯酰胺凝胶电泳的染色方法很多，常用到的有氨基黑染色、考马斯亮蓝染色、银染色和荧光染色等方法。

其中，考马斯亮蓝染色由于比氨基黑染色灵敏度更高，比银染色操作更简便，并且重复性高，具有非常好的质谱兼容性，是目前最为常用的蛋白凝胶电泳染色方法。其原理是考马斯亮蓝可与蛋白质形成较强的非共价复合物。考马斯亮蓝分子上的芳香苯环与蛋白质的疏水区结合，同时考马斯亮蓝分子上的亚硫酸基团与蛋白质的正电荷结合，在可见光下显蓝色。根据考马斯亮蓝的光谱特性还可进一步估算溶液中蛋白质的含量，在595 nm的最大吸收波长下测量溶液的光学吸光度，该方法具有高灵敏度，最高可辨别5μg的蛋白质。

考马斯亮蓝有G-250和R-250两种。考马斯亮蓝G-250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。根据科学出版社2001年出版的《蛋白质技术手册》，经典的R250考马斯亮蓝配方是：每升考马斯亮蓝染液含考马斯亮蓝R-2501.0g、甲醇450ml、蒸馏水450ml、冰醋酸100ml；每升脱色液含甲醇100ml、冰醋酸100ml、蒸馏水800ml。考马斯亮蓝染色的常规方法是：1)将胶移入一个小的盛有少量考马斯亮蓝的容器内，或将玻璃板连同凝胶浸在染料中轻轻振荡直至凝胶脱落；2)对于0.75mm的凝胶，可在据床上缓慢震荡5-10min；对于1.5mm的凝胶，则为10-20min；3)弃去染液，将凝胶在水中漂洗数次；4)加入考马斯亮蓝脱色液(约50ml)，清晰的条带很快会显现出来，大部分凝胶脱色需要1 h，使用过的脱色液则可用水冲洗掉。为了脱色完全，需数次更换脱色液并震荡过夜。该方法的缺点是灵敏度不高，检测下限仅为200-500ng，背景较高，而且染色液中含有对人体有害的甲醇、冰醋酸等。

目前市售的考马斯亮蓝染色液存在的主要问题是染色和脱色时间长、灵敏度低（检测下限仅为200-500ng），且含有剧毒的甲醇及强刺激性的乙酸。

目前也有针对经典考马斯亮蓝配方进行的改进，如中国发明专利CN104004382B，采用了加入可溶性淀粉的方案，可以在20 min内完成染色，然而淀粉在溶液中保质期短，并且该可溶性淀粉的制作最长需要7天，步骤繁琐，因此限制了这一技术的使用。

因此，蛋白染色领域中需要一种成本低、制备简便、环保无毒害、储存时间长、重复性高且具有非常好的质谱兼容性的染色配方。除此之外，还需要解决染色、脱色时间过长的问题，现行的配方染色时间通常要达到30min以上才能达到较好的实验结果。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种蛋白质电泳染色液，它配方简单，染色效果好，染、脱色速度快，且无毒无害，成本低。

为解决上述技术问题，本发明的蛋白质电泳染色液，配方中包含有考马斯亮蓝、浓盐酸和水。