[发明专利]RNA转录载体及其用途

说明书

本发明涉及一种改进的RNA转录载体，其非常适合用于产生用于体内治疗目的的mRNA。载体中的改进在于翻译增强子(TE)和核保留元件(NRS)的存在，特别是当后者是卡波西肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)的“表达和核保留元件”(ENE)时。

本申请是中国专利申请CN201480071159.0的分案申请。

发明领域

本发明总的来说涉及一种改进的RNA转录载体，其非常适合用于产生用于体内治疗目的的mRNA。载体中的改进特别地在于翻译增强子和核保留元件的存在。

发明背景

虽然我们的免疫系统能够区分健康细胞与肿瘤细胞和感染原，但它有时无法适当识别该问题并对其作出反应。因此，医学已经聚焦于开发几种帮助免疫系统监视和消除肿瘤细胞和感染原的策略。树突状细胞(DC)是已知为免疫应答刺激中的关键参与者的抗原提呈细胞 (APC)并且已付出许多努力来在免疫疗法中开发DC。例如在癌症的情况下，目标是通过诱发可以特异性降低肿瘤负荷并诱导免疫记忆以控制肿瘤复发的效应T细胞来诱导和保持肿瘤特异性免疫应答。一旦可靶向的肿瘤相关抗原(TAA)已被识别，它们可用于在体内或离体加载专职APC，即树突状细胞。

已关于DC就体内或离体免疫疗法评估了不同的抗原形式，例如肽、蛋白质、全肿瘤细胞提取物、质粒DNA或mRNA。在这些方法中，编码抗原的mRNA正作为为特别有前景的方法出现。相对于使用肽的传统疫苗接种的优点是mRNA编码整个抗原的遗传信息。全长抗原是经加工的并且所有可用的表位提呈在患者的MHC分子中，而不需要确定HLA特异性肽。没有患者需要因可用的肽不匹配其HLA类型而被从治疗中排除。此外，mRNA不构成基因组整合的风险，从而使其相较于DNA或病毒载体具有有利的安全性特征。由于它的瞬时性质，mRNA仅在短时期过程中表达，并最终降解成天然产物。另外， mRNA用作其自身的佐剂，促进共刺激信号，这在基于mRNA的免疫疗法的情况下是有利的。已应用了用于外源mRNA递送到DC中的两条路径：离体使用经转染的DC的后续过继转移或通过mRNA的直接施用和体内摄取。

由Diken等人(2011)进行的研究突出显示成熟刺激和/或其递送的时间选择必须仔细选择，因为mRNA的摄取依赖于巨胞饮，其是未成熟DC的功能，一旦DC成熟则丢失。因此，传统成熟刺激例如脂多糖(LPS)与TAA mRNA的共递送对抗原的生物利用度具有负面影响，抗原的生物利用度是共同决定抗原特异性T细胞应答的诱导的参数(Van Lint 2012；Diken2011)。迄今为止，已研究了两种不同的策略来用TAA mRNA同时加载DC并在体内激活它们。

Fotin-Mleczek等人(2011)描述了含有游离mRNA和与鱼精蛋白复合的mRNA的双组分系统，从而提供用于适应性免疫的抗原来源以及增强的病原体识别受体TLR7的触发。这种免疫策略导致强抗肿瘤免疫应答的诱导和持久的记忆应答，这是重要的，因为记忆T细胞应防止肿瘤的再现。

Bonehill等人,2008评估了mRNA的特定组合用于佐剂目的的用途，最初用于活化离体产生的DC，但也同样适用于直接施用和体内摄取(Bonehill，2008)。这已导致了专利申请(WO2009034172)，其中发明人描述了抗原性肽脉冲的抗原提呈细胞或用编码TAA的 mRNA(共)电穿孔的抗原提呈细胞的T细胞刺激能力可通过对其提供不同的分子佐剂(通过使用编码两种或更多种免疫刺激因子的 mRNA或DNA分子的混合物电穿孔)来极大增强。提供的概念证明是这样的用靶特异性肽脉冲的或用编码靶特异性抗原的mRNA共电穿孔的经修饰的抗原提呈细胞在体外和疫苗接种后均能刺激抗原特异性T细胞，从而形成有前景的用于抗肿瘤、抗病毒、抗细菌或抗真菌免疫疗法的新方法。用于该发明的免疫刺激因子的优选组合是CD40L 和caTLR4，或CD40L和CD70。在其它优选的实施方案中，使用CD40L、CD70和caTLR4免疫刺激分子的组合，其在下文被称为“TriMix”。