[发明专利]一种人工设计质粒pM5500及其在DNA marker制备中的应用

说明书

本发明公开了一种人工设计质粒pM5500及其在DNA marker制备中的应用，所述质粒的长度为5500bp，序列为：SEQ ID NO：1，包含高拷贝复制起始点序列和氨苄青霉素抗性基因编码序列，以及各种人工设计组合的DNA片段。该质粒在有限长度内包含了12个同种限制性内切酶识别位点，通过单酶切可产生1500、1000、750、500、250和100bp六种适用于中等分子量DNA marker制备的DNA片段，且各种片段的质量比为3:2:3:1:1:1。该质粒结构紧凑稳定，拷贝数高，易于大规模制备，以其为基础开发的DNA maker可广泛应用于生物学研究及生物技术领域。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及分子生物学、基因工程和生物技术应用，具体涉及一种人工创制质粒pM5500及其在DNA marker制备中的应用。

背景技术

DNA marker是已知大小和数量DNA片段的混合物，常用于核酸电泳，用于指示未知DNA样品的大小、型态和相对质量。作为一种最基础的生物学和生物技术研究工具，DNAmarker具有不可替代的作用和应用市场。

目前用于DNA marker制备的DNA片段主要有三种来源，其一是通过噬菌体或质粒酶切获得、其二是通过PCR扩增获得、第三种是通过化学合成获得。单链或双链短片段(100bp或100nt以下)使用化学合成即可，100～5000bp采用质粒酶切或PCR扩增，更大的片段则适合通过第一种方案获得。通过PCR获得目标片段存在工作量大、扩增产物不专一、引物难以去除、长片段扩增效率低、片段配比需反复优化等问题。质粒酶切是获得制备DNAmarker所需DNA片段的主流方法，该方法具有目标片段配比固定、可通过发酵大量制备等优点。但也存在投入大、质粒纯化流程需要严格控制、需要避免基因组DNA和RNA污染等问题。

设计DNA marker制备质粒通常要考虑三个问题：其一是质粒中限制内切酶的切点和各种目标DNA片段的数量；其二是质粒的稳定性；其三是质粒的扩增效率。通常质粒的大小越小则稳定性和扩增效率越好，因而设计该类质粒时尽量在有限的长度内包含尽量多类型的片段；同时为了最终各种片段在电泳时亮度差异不至于过大，需要合理调整各种片段的数目。质粒的稳定性与质粒本身的序列有极大关系，如果存在重复序列，必将影响质粒的稳定性。目前用于DNA marker制备的质粒会尽量设计紧凑，尽量使得目标片段的质量趋于一致。但在实际使用过程中，DNA marker不仅需要片段大小合理，用于指示各种大小不同片段，而且需要各种目标条带的质量数有一定差异，用于目标片段的相对定量。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明公开了一种用于中等分子量DNA marker制备的质粒pM5500及构建方法，解决目前中等分子量DNA marker制备质粒结构不够紧凑，制备过程复杂繁琐的问题。

基于此，本发明采用的技术手段包括：

本发明首先公开一种用于中等分子量DNA marker制备的质粒pM5500，其序列为SEQ ID NO：1所示。

此外，所述质粒大小为5500bp，包含6种适用于中等分子量DNA marker制备的DNA片段，大小依次为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp和1500bp；所述质粒中上述DNA片段的相对质量比依次为1:1:1:3:2:3。

更进一步，上述质粒包含了同一种限制性内切酶的12个切点，包括BamH I切点、EcoR I或Hind III中的一种或多种。

此外，上述质粒包含高拷贝复制起始点序列和氨苄青霉素抗性基因编码序列，以及上述6种适用于中等分子量DNA marker制备的DNA片段。

同时，本发明公开一种上述质粒的构建方法，主要核心点包括：以pBR322/pUC系列高拷贝质粒为基础，引入限制性内切酶识别位点，然后在多克隆位点引入包含同种限制性内切酶的6个DNA片段。