[发明专利]一种硫酸软骨素的制备方法及应用

权利要求书

1.一种硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：所述硫酸软骨素的制备方法包括以下步骤：

预处理：将软骨原料加去离子水浸没并蒸煮，去除软骨表层附着的肌肉组织及油脂，蒸煮温度为50-60℃，蒸煮时长为12-18小时，并将蒸煮后的软骨原料粉碎；

第一次提取：将预处理步骤后的软骨原料转移至超声波萃取器中，用去离子水浸没并加入按溶液体积计3%的氯化钠，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH为8-9，升温至40-60℃，加入按软骨重量计0.2-0.8%的复合酶，加入按溶液体积计0.1-0.2%有机缓冲液，维持溶液pH8-9，保温40-60℃，在频率20000HZ的超声波条件下振动60-90分钟，收集提取液；

第二次提取：用去离子水浸没第一次提取步骤后的软骨原料，加入按溶液体积计3%的氯化钠，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH为8-9，升温至40-60℃，加入按软骨重量计0.1-0.4%的单酶，加入按溶液体积计0.1-0.2%有机缓冲液，维持溶液pH8-9，保温50-60℃，在频率15000HZ的超声波条件下振动30-60分钟，收集提取液；

第一次超滤浓缩：将第一次提取及第二次提取步骤所得提取液混合，使用2000-3000分子量的超滤膜浓缩，得到浓缩液；

第一次醇沉：将第一次超滤浓缩步骤所得的浓缩液，使用氢氧化钠水溶液调节溶液pH为6-7，加入按溶液体积计3%的氯化钠，再加入乙醇，使溶液乙醇浓度达到60-70%，收集沉淀物；

沉淀物处理：将第一次醇沉步骤所得的沉淀物，与按重量计1-3%的石墨粉混合均匀；

第三次提取：将处理得到的沉淀物转移至超声波萃取器中，用去离子水浸没并加入按溶液体积计3%的氯化钠，使用盐酸溶液调节溶液pH为6-7，升温至40-50℃，加入按软骨重量计0.1-0.4%的单酶，加入按溶液体积计0.1-0.2%有机缓冲液，保温40-50℃，在频率20000HZ的超声波条件下振动30-60分钟，收集提取液，其中，所用单酶为链霉蛋白酶，所用有机缓冲液为氯仿、丁醇、己醇、戊醇中的一种；

过滤：将第三次提取步骤所得提取液加入真空抽滤机中，分别收集分离出的固体及液体；

第二次超滤浓缩：将过滤步骤所得液体，使用2000-3000分子量的超滤膜浓缩，得到浓缩液；

第二次醇沉：将第二次超滤浓缩步骤所得的浓缩液，使用盐酸溶液调节溶液pH为6-7，加入按溶液体积计3%的氯化钠，再加入乙醇，使溶液乙醇浓度达到70-80%，收集沉淀物；

醇洗脱水：将第二次醇沉步骤所得的沉淀物，使用80%浓度的乙醇水溶液洗涤后，使用95%浓度的乙醇水溶液脱水，干燥后得到成品硫酸软骨素；

其中，第一次提取步骤中所用复合酶为比例为1-2:1的碱性蛋白酶及胰酶，第二次提取步骤中所用单酶为碱性蛋白酶及胰酶中的一种，第一次提取、第二次提取中所用有机缓冲液为氯仿、丁醇、己醇、戊醇中的一种。

2.根据权利要求1所述硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：所述第一次提取步骤中，按软骨重量计，复合酶的用量为0.8%，复合酶中碱性蛋白酶及胰酶的比例为1:1，按溶液体积计，有机缓冲液的用量为0.1%，超声波振动时长为90分钟。

3.根据权利要求2所述硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：所述第二次提取步骤中，按软骨重量计，单酶的用量为0.4%，按溶液体积计，有机缓冲液的用量为0.1%，超声波振动时长为45分钟。

4.根据权利要求3所述硫酸软骨素的制备方法，其特征在于：所述第三次提取步骤中，按软骨重量计，单酶的用量为0.4%，按溶液体积计，有机缓冲液的用量为0.1%，超声波振动时长为45分钟。

5.一种如权利要求1-4任一项所述硫酸软骨素的制备方法所得的硫酸软骨素在制备动脉粥样硬化疾病药物中的应用。