[发明专利]一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法及其应用

说明书

本发明属于生物技术与植物分子生物学领域，特别涉及一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法及其应用，为便于分离不用花生组织器官的原生质体，本发明根据花生组织细胞的特定结构，提供了一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法，该方法是一种适用于分离不同花生组织细胞的通用方法，能够快速、高效地制备出不同花生组织器官的原生质体细胞，所分离得到的花生原生质体，不仅获得率高，而且细胞活性好，可应用于花生体细胞的融合，花生蛋白质瞬时表达系统的开发，花生单细胞的测序以及基于CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1的敲除靶点检测等花生分子生物学相关研究。

技术领域

本发明属于生物技术与植物分子生物学领域，特别涉及一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法及其应用。

背景技术

植物原生质体是除去细胞壁后质膜包裹的细胞，可以在较短时间内获得大量遗传上具有同质性的细胞，并可以直接摄取外援的质粒和DNA等，因此成为植物遗传转化的良好受体材料，对基因功能研究意义重大；原生质体含有个体的全部遗传信息，并可以产生重要次生代谢产物，对其进行分离提取检测，可以为代谢物生产提供新思路；原生质体还被广泛应用于体细胞远源杂交，能够克服杂交障碍，是种质创新的有效途径。

花生(Arachis hypogaea L.)是一种常见的油料作物，属于异源四倍体豆科植物，具有典型的地上开花地下结果的特性。由于花生的生长发育阶段具有多种特殊的农艺表现，因此可作为特异材料用于研究多种生物学问题。目前，花生的分子生物学技术发展迅速，基于混池测序(Bulk-seq)技术利用其组织器官可构建大量基因的表达图谱，但是从组织水平到单个细胞水平并没有十分有效的解决办法。花生单个细胞间具有较厚的细胞壁，细胞壁的成份主要由纤维素、木质素、果胶、角质细胞等成分组成，不同器官中细胞壁的具体组分存在明显的差异。由于细胞壁难以去除，导致花生单细胞的分离存在明显的技术壁垒。

当前，分离原生质体最为有效的方式是利用由纤维素酶与果胶酶等酶组成的酶解液将细胞壁消化掉。但去除细胞壁的酶解液并没有统一的配置标准，需要根据植物种类的差异，安照不同植物细胞的渗透压进行调配，导致研究效率不高。因此，根据花生组织细胞的特定结构，开发一种能够应用于分离不同组织细胞的通用方法，将在很大程度上促进花生分子生物学的研究效率。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法。

本发明的第二个目的是提供采用上述的分离方法制备得到的花生原生质体的应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

本发明提供了一种用于分离花生不同组织器官原生质体的方法，该方法包括以下步骤：

S1、将花生不同组织器官切割成细小组织，然后进行反复冻融处理；

S2、往冻融处理后的组织器官中加入酶解液，然后置于恒温振荡条件下进行酶解处理，所述酶解液包括纤维素酶、离析酶、崩溃酶、阿魏酸酯酶、皂荚皂素、山梨醇、甘露醇、MES溶液和BSA；

S3、酶解后进行过滤、离心处理，收集沉淀即得原生质体。